engenharia genética de Phaeodactylum tricornutum e otimização das condições de crescimento

Microalgas são um recurso biotecnológico importante, constituindo uma fonte de metabolitos e produtos valiosos como lípidos, proteínas, vitaminas e pigmentos. Os carotenoides são pigmentos que apresentam uma função fotoprotetora não só em plantas como em macro e microalgas. A fucoxantina é um caroteno que apresenta atividade anticancerígena, antiobesidade, antihipertensiva e anti-inflamatória. Representa um dos pigmentos mais abundantes em microalgas castanhas e diatomáceas. A sua produção em escala comercial tem enfrentado vários desafios, uma vez que a síntese por via química não é eficiente, devido à instabilidade do composto perante a oxidação e as altas temperaturas decorrentes do processo de purificação. Para contornar estes desafios, a fucoxantina já é produzida a partir de espécies de macroalgas, mas esta produção não é viável devido à baixa concentração de fucoxantina dentro das células destas espécies. O presente trabalho visa aumentar a produção de fucoxantina na estirpe de diatomácea Phaeodactylum tricornutum CCAP1055/1, para que se torne uma fonte comercialmente sustentável deste composto. Para isto utilizaram-se duas abordagens diferentes: alteração da formulação dos meios de cultivo da microalga e manipulação genética da via metabólica da fucoxantina. Para aumentar a produção de fucoxantina nas células de P. tricornutum, através da manipulação da composição dos meios de cultura, procedeu-se ao aumento da fonte de azoto a à adição de um composto orgânico. Ao meio utilizado para o crescimento da microalga, F/2+Sí, foi aumentada 10x a concentração de NaNO3 e adicionado glicerol a concentrações diferentes: 0,1M ou 0,05M. O crescimento nos diferentes meios testados foi aferido por contagem das células, a cada 2 dias durante 8 dias, bem como a quantificação de fucoxantina, que foi analisada através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados indicam que o aumento da concentração de NaNO3 conduziu a uma duplicação da produção de biomassa e de fucoxantina, quando comparada com o meio F/2+Sí. A suplementação com glicerol no meio de cultivo não provocou efeitos no crescimento das células e diminuiu significativamente a produção do pigmento alvo. Por outro lado, pretendeu-se utilizar ferramentas de engenharia genética para sobreexpressar um gene pertencente à via de síntese da fucoxantina, que codifica a enzima Licopeno β-ciclase (LCYB). Este foi amplificado a partir do genoma das células para se proceder à sua clonagem no plasmídeo pPha-T1, utilizado para a transformação de P. tricornutum por eletroporação. O objetivo de transformar as células está ainda em curso, no entanto, foi clonado um gene repórter, Gfp, no vetor pPha-T1, de modo a facilitar a visualização de células transformadas, e onde será posteriormente inserido o gene de interesse. Após a obtenção das células transformadas com o gene-alvo, seria relevante proceder a uma comparação da produção de fucoxantina, e perceber se a sobreexpressão do gene Lcyb aumenta a produção deste pigmento