Influence of antiandrogen vinclozolin on porcine ovary function : an in vitro study

Androgeny to kluczowe związki biorące udział w regulacji procesów rozrodczych u samicy, działające głównie przez receptor androgenowy (AR), należący do nadrodziny receptorów jądrowych. Androgeny są jednymi z ważniejszych związków wpływających na proces folikulogenezy. Z jednej strony modulują funkcje pęcherzyka poprzez interakcje z różnymi czynnikami i wspierają różnicowanie komórek ziarnistych. Z drugiej strony, mogą hamować rozwój pęcherzyka poprzez indukcję procesu apoptozy komórek ziarnistych, co w konsekwencji może prowadzić do atrezji pęcherzyka jajnikowego. W jajnikach ssaków większość pęcherzyków ulega atrezji przed owulacją. Coraz częściej mówi się, że substancje występujące w środowisku, mogą w sposób zasadniczy wpływać na procesy życiowe wielu organizmów, w tym na różnicowanie płci u ssaków. Związki te, to Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs), czyli m. in. związki powstające w wyniku działalności człowieka, przedostające się do środowiska i w efekcie zaburzające regulację hormonalną poprzez interakcje z receptorami hormonów steroidowych. Taki mechanizm działania negatywnie wpływa na szereg procesów zachodzących w układzie rozrodczym samicy. Celem prezentowanej pracy było określenie wpływu androgenów, testosteronu (T) i dihydrotestoseronu (DHT) oraz fungicydu o właściwościach antyandrogennych, winklozoliny (Vnz) na ekspresję AR na poziomie mRNA i białka, aktywność steroidogenną i mechanizm apoptozy zarówno w komórkach ziarnistych jak całych pęcherzykach jajnikowych świni (Ø 4-6mm). Komórki ziarniste izolowane z pęcherzyków jajnikowych hodowano przez 24 godziny i następnie dodawano: T (10-7M), DHT (10-7M) i Vnz (1,4×10-5M) osobno lub w kombinacji: T i Vnz lub DHT i Vnz na kolejne 24 godziny. Całe pęcherzyki jajnikowe hodowano narządowo przez 24 godziny, stosując warianty hodowli takie jak w przypadku hodowli pierwotnych. Androgeny (T, DHT) i antyandrogen środowiskowy winkolzolina (Vnz) wpływają na ekspresję AR na poziomie mRNA i białka w komórkach ziarnistych pęcherzyków jajnikowych świni. Wykazano lokalizację cytoplazmatyczną i około jądrową AR w komórkach ziarnistych traktowanych Vnz. Stwierdzono wzrost ekspresji AR na poziomie mRNA i białka w komórkach ziarnistych pod wpływem Vnz oraz kombinacji T+Vnz lub DHT+Vnz. W przypadku pęcherzyków jajnikowych hodowanych w obecności androgenów i antyandrogenu jednocześnie (T+Vnz i DHT+Vnz) obserwowano wzrost ekspresji mRNA AR z jednoczesnym spadkiem ekspresji na poziomie białka. W komórkach ziarnistych i pęcherzykach jajnikowych świni androgeny (T i DHT) oraz antyandrogen (Vnz) wpływają na aktywność steroidogenną. Zmiany poziomu hormonów steroidowych, tak w medium hodowlanym jak w płynie pęcherzykowym, świadczą o zaburzonym przebiegu steroidogenezy w komórkach ziarnistych i całych pęcherzykach jajnikowych świni. Androgeny (T, DHT) i antyandrogen środowiskowy winkolzolina (Vnz) wpływają w sposób znaczący na mechanizm apoptozy. Obserwowano zmiany morfologii komórek ziarnistych i całych pęcherzyków jajnikowych świni, co świadczy o destrukcyjnym wpływie tych związków na prawidłową strukturę komórki i pęcherzyka. Vnz powoduje nekrozę hodowanych komórek ziarnistych oraz indukuje apoptozę komórek ziarnistych w całych pęcherzykach jajnikowych. Wykazano, że dodanie T, DHT lub Vnz do medium hodowlanego komórek ziarnistych lub pęcherzyków powoduje uruchomienie procesu programowanej śmierci komórki, ponieważ obserwowano wzrost ekspresji i aktywności kaspazy-3. Vnz zakłóca klasyczny receptorowy oraz mitochondrialny szlak apoptozy. Ponadto wykazano, że traktowanie komórek ziarnistych Vnz powoduje spadek ekspresji białek antyapoptotycznych, z jednoczesnym brakiem wzrostu ekspresji białek proapoptotycznych. Prawdopodobnie stosowanie Vnz wpływa na prawidłowe podziały komórki (zatrzymuje cykl komórkowy), gdyż obserwowano spadek ekspresji białka p53 i surwiwiny. Co więcej, dodanie Vnz do medium hodowlanego komórek ziarnistych skutkuje wzrostem fosforylacji kinazy ERK1/2 i Akt. Sugeruje to pozagenomowy mechanizm działania Vnz. Co ważniejsze, prezentowane badania wykazały zdecydowanie antyapoptotyczne działanie wysokiego stężenia androgenów stosowanych jednocześnie z Vnz, o czym m. in. świadczy spadek ilości komórek apoptotycznych i aktywności kaspazy-3. Podsumowując uzyskane wyniki, można stwierdzić, że winklozolina może zaburzać prawidłowe funkcje jajnika, ponieważ działając za pośrednictwem AR uruchamia niegenomowe szlaki przekazywania sygnału i zakłóca fizjologiczne procesy programowanej śmierci komórkowej. W konsekwencji może to prowadzić do obniżenia potencjału rozrodczego samicy.Androgens are the key regulators in female reproductive physiology. They act primarily via the androgen receptor (AR), a member of the nuclear receptor superfamily, which operates as ligand-regulated transcription factor. Androgens are one of the most important agents influencing folliculogenesis. They can modulate follicular function by interactions with various factors and promote granulosa cells differentiation. On the other hand, androgens can antagonize follicular development by inducing apoptosis in granulosa cells and in this way they can promote follicular atresia. In mammalian ovaries the majority of follicles are lost at various stages before ovulation by atresia. Recently, there has been an increasing concern about potential for Environmental Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to alter sexual differentiation in mammals. They originate as a result of human industrial activities, enter the natural environment and then disturb hormonal regulation by interaction with steroid hormone receptors. Such a mechanism of action negatively influences on many process taking place in the reproductive tract of a female. The aim of this study was to investigate whether the androgens testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT) and the antiandrogenic fungicide vinclozolin (Vnz) influence AR expression on mRNA and protein level, steroidogenic activity, and mechanism of apoptosis both in granulosa cells and in whole porcine ovarian follicles (Ø 4-6mm). Granulosa cells isolated from pig follicles were cultured for 24 hours, and then were exposed to T (10-7M), DHT (10-7M), Vnz (1,4×10-5M) or the equivalent concentrations of T and Vnz or DHT and Vnz for further 24 hours. Whole porcine follicles were also exposed to the same compounds and combinations of compounds for 24 hours. Androgens (T and DHT) and an antiandrogen (Vnz) influence on AR mRNA and protein expression in porcine ovarian granulosa cells and whole follicles. The immunostaining for AR was detected mainly in the cytoplasm and assembled in the perinuclear region after exposure to Vnz. Treatment with Vnz and combinations of T+Vnz and DHT+Vnz, granulosa cells resulted in an increase in the expression of AR on both mRNA and protein levels. In the whole follicles treatment with T+Vnz and DHT+Vnz resulted in an increased expression of mRNA for AR with simultaneous decrease of AR protein. In porcine granulosa cells and whole ovarian follicles androgens (T and DHT) and an antiandrogen (Vnz) affected their steroidogenic activity. Incorrect or disturbed process of steroidogenesis was observed in all experimental groups of cells and follicles. Besides all compounds tested caused the disturbance of hormonal balance in the follicular fluid. Androgens (T and DHT) and an antiandrogen (Vnz) in a significant manner influenced on the mechanism of apoptosis. Morphological changes in granulosa cells and ovarian follicles indicated destructive effects of this agents. Vnz caused massive necrosis of granulosa cells and induced apoptosis of granulosa cells in whole follicles. Androgens induced apoptosis in granulosa cells of ovarian follicles . It was found out that the addition of T, DHT or Vnz to the culture media of granulosa cells or follicles caused the induction of the process of programmed cell death, because an increased caspase-3 expression and activity have been observed. It seems that Vnz disrupted classical receptor and mitochondrial signaling pathways of apoptosis. Also, it was shown that Vnz treatment caused a decrease in the expression of antiapoptotic proteins, but without an increase in that of proapoptotic ones. Probably supplementation with Vnz altered normal cell division (cell-cycle arrest), because a decrease in p53 and survivin proteins expression has been observed. Moreover, the addition of Vnz to the culture media of granulosa cells increased phosphorylation of ERK1/2 and Akt kinases. It is suggested that Vnz may interfere with the nongenomic pathway of androgens signaling. What is more important, the presented data clearly showed that Vnz applied together with high concentration of androgens (T and DHT) exerted an antiapoptotic effect, as evidenced by the decreased number of apoptotic cells and caspase-3 activity. In conclusion, these results suggest that normal function of the ovary may be destroyed by the environmental antiandrogenic fungicide vinclozolin. It can activate the nongenomic signaling pathway used by androgens or act through the AR. This mechanism of action disturbs the physiological process of programmed cell death. It seems that selective destruction of porcine follicles is a serious consequence of their exposure to vinclozolin leading to premature ovarian failure in the affected organism