In vitro Charakterisierung poröser biofunktionalisierter Eisenschäume als Knochenimplantate

Während Korrosionsbeständigkeit bisher ein wichtiges Kriterium bei der Materialentwicklung von metallischen Implantaten war, erlangen korrodierbare Metalle wie zumeist Magnesium aber auch Eisen zunehmend Bedeutung in der gegenwärtigen Forschung. Magnesium ist ein osteokonduktives Material und stimuliert die Knochenneubildung. Nachteil ist jedoch die geringe Korrosionsbeständigkeit, sodass Magnesium in der Regel in vivo schneller abgebaut wird, als neuer Knochen gebildet werden kann. Verglichen mit Magnesium ist die Korrosion von elementarem Eisen in vivo langsam und zeigt keine lokale oder systemische Zytotoxizität. Während die meisten Forschungsarbeiten Eisen als degradierbares Implantatmaterial mit dem Ziel der kardiovaskulären Anwendung untersuchen, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit Eisenschäumen, die u.a. zur Heilung überkritisch großer und belasteter Knochendefekte eingesetzt werden sollen. Die Herstellung der Eisenschäume (Fe) erfolgt durch Pulvermetallurgieprozesse an den Fraunhofer-Instituten IKTS und IFAM in Dresden. Polyurethanschäume werden mit einer Carbonyleisensuspension mit 3,8 % Fe3P beschichtet, getrocknet, erhitzt und anschließend der verbleibende Eisenschaum gesintert. Die Bioaktivierung der Eisenschäume mit verschiedenen Calciumphosphatphasen erfolgt durch die InnoTERE GmbH. Hierfür werden die Eisenschäume phosphatiert und mit Brushit (Fe-B) beschichtet. Durch anschließendes Kochen bei 95 – 100 °C in 0,1 M NaOH für 24 h kann eine Hydroxylapatitschicht (Fe-HA) erhalten werden. Eine weitere Methode der Bioaktivierung stellt die Befüllung mit Calciumphosphat-Zementen dar. Dabei handelt es sich um einen von InnoTERE entwickelten Ein-Pasten-Calciumphosphat-Zement (1P PCP) und um einen magnesiumhaltigen Calciumphosphat-Zement (MgCPC). Die Eisenschäume werden mittels physikalisch-chemischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden im Hinblick auf Degradierbarkeit und Biokompatibilität in vitro untersucht und charakterisiert. Wesentliche Ziele der vorliegenden Arbeit sind neben der Charakterisierung des Korrosionsverhaltens, vor allem die Analyse der Reaktionen knochentypischer Zellen auf Beschichtungen sowie Korrosionsprodukte der metallischen Grundstruktur. Für die zellbiologischen Untersuchungen dienen die Osteoblastenzelllinie SaOs-2 sowie humane mesenchymale Stammzellen (hMSC). Es konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit der Beschichtung bzw. Füllung mit verschiedenen Calciumphosphatphasen die Eisenfreisetzung und damit das Korrosionsverhalten von Eisenschäumen variiert werden kann. Die höchsten Korrosionsraten sind bei unmodifizierten Eisenschäumen zu beobachten. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit erfolgt eine verminderte Eisenfreisetzung. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. die Füllung mit Magnesium-Calciumphosphat Zement wird die Freisetzung von Korrosionsprodukten nahezu vollständig unterbunden. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. HA wird neben dem Korrosionsverhalten auch die Bioaktivität der Proben beeinflusst. Während die unmodifizierten Fe in beiden untersuchten Zellkulturmedien sowie Fe-B in McCoys keinen Einfluss auf den Calcium- und Phosphatgehalt haben, ist bei Fe-B in DMEM über den gesamten Untersuchungszeitraum eine konstante Calcium- und Phosphatfreisetzung zu beobachten. Die bioaktiven Fe-HA zeigen den umgekehrten Effekt und entziehen dem Medium Calcium und Phosphat – in DMEM Calcium stärker als in McCoys und in McCoys Phosphat stärker als in DMEM. Für das erfolgreiche Einwachsen von Implantaten bzw. die Heilung von Knochendefekten sollten Zellen, die am Knochenauf- und -umbau beteiligt sind, durch das Einbringen des Implantats nicht negativ beeinflusst werden. Ein Schlüsselereignis stellt dabei die Adhäsion dar. Die beste Adhäsion ist für die beide getestete Zelltypen auf Fe-B zu beobachten. Für Fe-HA werden die zweitbesten Adhäsionseffizienzen erzielt. Während für die Osteoblasten dabei das Zellkulturmedium keinen Einfluss hat, ist für die Stammzellen im Vergleich zu den SaOs-2 Zellen allerdings nur eine halb so gute Adhäsion zu beobachten. Die mit MgCPC bzw. mit 1P CPC gefüllten Schäume dagegen zeigen eine sehr schlechte Adhäsion sowohl von Osteoblasten als auch von Stammzellen. Für Fe-B+1MgCPC kann jedoch durch eine Erhöhung der Inkubationszeit von 4 h auf 24 h der Anteil an adhärenten Zellen deutlich gesteigert werden. Entsprechend des Korrosionsverhaltens adhärieren auf den unmodifizierten Eisenschäumen die Zellen am schlechtesten. Darüber hinaus können sowohl SaOs-2 als auch hMSCs auf den CPP-beschichteten Fe nicht nur adhärieren, sondern auch proliferieren. Die eine wesentlich höhere Proliferationsrate aufweisenden SaOs-2 zeigen sowohl auf Fe-B als auch auf Fe-HA eine sehr gute Proliferation. Die langsamer proliferierenden Stammzellen dagegen zeigen ein etwas anderes Zellverhalten. Während auf Fe-B ebenfalls eine gute Proliferation zu beobachten ist, nimmt die Zellzahl auf Fe-HA zu Beginn der Inkubation zunächst ab. Mit der Zeit sinken Eisenfreisetzung und Calciumbindung, sodass ab Tag 14 auch hier eine Zunahme der Zellzahl zu beobachten ist. Die Perfusionskultur stellt ein Kultursystem dar, das den in vivo Bedingungen näher ist, als eine statische Kultivierung in Zellkulturwellplatten, sodass die Proliferation von SaOs-2 und hMSCs auf Fe-HA signifikant verbessert werden kann. Während für die unmodifzierten Fe bereits bei den SaOs-2 Zellen weder statisch noch dynamisch eine Zellzahlzunahme zu beobachten ist, kann für Fe-B+MgCPC die Proliferation durch die Perfusion verbessert werden. Für Fe-HA kann durch die Verwendung in vivo naher Zellkulturbedingungen die Proliferation beider Zelltypen entscheidend verbessert werden. Für die Fe-B zeigen die Zellen bereits in der statischen Kultur eine gute Proliferation, die durch die Perfusion nicht wesentlich gesteigert werden kann. Die Untersuchungen zum osteogenen Differenzierungsverhalten zeigen sowohl bei indirekter Inkubation in Fe-B und Fe-HA Extrakten als auch im direkten Materialkontakt auf den CPP-bioaktivierten Fe, dass die untersuchten hMSCs in der Lage sind osteogen zu differenzieren und mineralisieren. Die Genexpressionsergebnisse bestätigen die Beobachtungen der biochemischen Analyse. Im Fall der alkalischen Phosphatase (ALP) wird der Effekt bei den Fe-HA Extrakten sogar noch deutlicher. Sowohl im Basis- als auch im Differenzierungsmedium zeigen die Zellen eine erhöhte ALP-Genaktivität. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit kann auf den Fe-HA eine zeitigere Aktivierung der osteoblastären Differenzierung im Vergleich zur Plastikoberfläche beobachtet werden. Durch die Perfusionskultur ist aufgrund des Zusammenspiels von Stofftransport und Scherkräften eine gesteigerte Differenzierung der hMSCs auf den mit CPP beschichteten Fe zu beobachten – auf Fe-HA stärker als auf Fe-B. Durch die korrosionsbedingte Eisenfreisetzung reagieren die hMSCs mit erhöhter Genexpression des Eisenspeicherproteins Ferritin bei gleichzeitig sinkender Genexpression für den Transferrinrezeptor CD71. Reaktive Sauerstoffspezies und der damit verbundene oxidative Stress bewirken eine erhöhte Genexpression von Enzymen der oxidativen Stressabwehr. Es handelt sich dabei um die im Zytoplasma vorkommende Superoxiddismutase SOD1 und die in den Mitochondrien lokalisierte SOD2 als primäre Enzyme und um die Glutathion-Reduktase als sekundäres Enzym. Die Genregulierung von Katalase, Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Synthetase wird ebenfalls teilweise durch die Anwesenheit von Fe beeinflusst. Fazit Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Eisenschäume korrodieren in Abhängigkeit ihrer CPP-Modifizierung mit unterschiedlicher Intensität sowie Geschwindigkeit und beeinflussen so das Zellverhalten von hMSC und Osteoblasten. Die Eisenfreisetzung, die für die unmodifizierten Schäume am höchsten ist, wirkt sich negativ auf Adhäsion und Proliferation aus. Sowohl statisch als auch dynamisch ist eine Abnahme der Zellzahl zu beobachten. Ohne Modifikation sind die Eisenschäume daher für eine Anwendung als Knochenersatzmaterial in vivo eher ungeeignet. Im Gegensatz dazu stellen die mit Brushit und mit Hydroxylapatit beschichteten Fe-Schäume interessante Knochenersatzmaterialien dar. Es konnte gezeigt werden, dass sie aufgrund ihrer Calciumbindungs- bzw. -freisetzungskapazität die am Knochenaufbau beteiligten Zellen und deren Differenzierungsverhalten in Richtung Osteoblasten positiv beeinflussen können. Die mit mit MgCPC und mit Einpastenzement gefüllten Eisenschäume konnten nur ansatzweise untersucht werden. Eine endgültige Einschätzung zur Eignung für eine in vivo Anwendung ist daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Dennoch sind sie vor allem im lasttragenden Bereich aufgrund guter mechanischer Eigenschaften innovative Knochenersatzmaterialien