In vitro Fibrillogenese von Kollagen Typ I in Gegenwart von Polymeren unter gerbereichemischem Aspekt

Gerbstoffe stabilisieren die Kollagenmatrix der Haut, in dem sie auf unterschiedlichste Art und Weise chemische Quervernetzungen herstellen. Es bleibt jedoch bis heute weitgehend unbeantwortet, auf welcher hierarchischen Ebene der Kollagenstruktur diese Wechselwirkung stattfindet und wie stringent eine solche Bindung mindestens sein muss, um einer Substanz den Charakter eines Gerbstoffes zu verleihen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, das es gestattet, Aussagen darüber zu treffen, auf welcher Strukturebene des Kollagens diese Wechselwirkung stattfindet. Dazu wurde auf ein „bottom-up“ Verfahren zurückgegriffen, bei dem der Gerbstoff nicht auf Haut aufgebracht, sondern die Fibrillen in Anwesenheit von verschiedenen Wirkstoffen neu gebildet werden. Für die Untersuchungen wurden Vertreter aus der Substanzklasse der Polymere ausgewählt. Es kam Polyacrylsäure zum Einsatz, die als Fettungsmittel genutzt wird, und Polymethacrylsäure, welche in der Produktion als Nachgerbstoff verwendet wird. Vertreter ungeladener Polymere waren Ethylen-, Diethylen- und Polyethylenglycol, wobei hier die unterschiedlichen Molekülgrößen im Vergleich von Bedeutung waren. Des Weiteren wurde Glutaraldehyd als Vertreter eines gerbenden kovalenten Vernetzers untersucht. Kollagen Typ I Fibrillen wurden in vitro ausgehend von der Monomerform assembliert, und mit UV/Vis-Spektroskopie wurde verfolgt, ob und gegebenenfalls wie die Polymere die Kinetik der in vitro Fibrillogenese verändern. Dabei wurde beobachtet, dass bis auf Polyethylenglycol alle eingesetzten Substanzen auf unterschiedlichste Art schon auf der kleinsten Kollageneinheit - der Tripelhelix wirken. Diese Daten wurden mittels eines mathematischen Modells ausgewertet, das es ermöglicht, die Fibrillogenese in Teilreaktionen zu gliedern und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte zu evaluieren. So konnte ermittelt werden, dass trotz ähnlich erscheinender Fibrillenbildungskinetiken große Unterschiede zwischen Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure bezüglich ihres Hauptwirkortes in den hierarchischen Strukturebenen des Kollagens auftreten. Während der Nachgerbstoff Polymethacrylsäure schon in geringen Konzentrationen in großem Maße in alle Teilprozesse der Fibrillogenese eingreift, zeigt Polyacrylsäure die größten Effekte auf mikrofibrillärer Ebene - einer Fibrillensubstruktur. Dieser Einfluss spiegelt sich in Morphologieänderungen in Form von so genannten gesplitteten Fibrillen wider, welche mittels atomkraftmikroskopischen Untersuchungen beobachtet werden konnten. Zusätzlich scheint Polymethacrylsäure ab einer kritischen Konzentration die Fibrillenbildung über einen alternativen Weg ablaufen zu lassen, was sich in der morphologischen Betrachtung in Form von langen, dünnen Fibrillen äußert, welche nicht mehr in der Lage sind zu höheren Strukturen zu verdrillen. Um zusätzlich die Art der Bindung näher zu charakterisieren, wurde ein weiteres Verfahren entwickelt, welches die Umkehrreaktion der in vitro Fibrillogenese beschreibt. Diese Methode der so genannten Deassemblierung ermöglicht eine Unterscheidung zwischen elektrostatischen Wechselwirkungen und kovalenten Bindungen zwischen Kollagen und Polymer, indem die Fibrille wieder in ihre nativen Monomeruntereinheiten zerlegt und gleichzeitig studiert wird, ob sich die Polymere vom Kollagen durch Ladungseintrag lösen lassen. Polyethylenglycol und seine niedermolekularen Äquivalente lassen sich in saurem Milieu problemlos von Kollagen abwaschen, was für sehr schwache Wechselwirkungen spricht. Kovalente Bindungen, wie etwa zwischen Kollagen und Glutaraldehyd lassen sich mit dieser Methode nicht lösen. Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure lassen sich nur zu einem geringen Anteil von Kollagen lösen, was auf unterschiedlich affine Bindungsplätze der Polymere an Kollagen deutet. Beeindruckender Weise ist es für ausschließlich mit Polymethacrylsäure vernetztes Kollagen nicht möglich, dieses wieder in seine Untereinheiten zu zerlegen. Polymethacrylsäure ist demnach in der Lage die Kollagenmatrix auch ohne die Ausbildung kovalenter Bindungen ausreichend zu stabilisieren. Damit können die eingesetzten und entwickelten Verfahren als Screeningmethoden gesehen werden, welche schon vor dem eigentlichen Gerbversuch weit reichende Auskünfte über ein mögliches Gerbverhalten der zu Untersuchung eingesetzten Substanz liefern. Die vorliegenden Ergebnisse erlauben Aussagen über den molekularen Charakter der Kollagen - Polymer Wechselwirkung und stellen somit einen Beitrag zum Verständnis der Gerbung dar