Osmotische Induktion des Komplementfaktors C9 in retinalen Pigmentepithelzellen

Ackmann, Charlotte Osmotische Induktion des Komplementfaktors C9 in retinalen Pigmentepithelzellen Universität Leipzig, Dissertation 98 Seiten, 208 Literaturangaben, 28 Abbildungen, 8 Tabellen Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Erwachsenen in den industrialisierten Ländern. Die AMD ist unter anderem eine chronisch entzündliche Erkrankung, bei der die Aktivierung der alternativen Komplementkaskade eine Rolle spielt. Daneben erhöht Bluthochdruck, der auch durch eine salzreiche Ernährung getriggert wird, das Risiko an einer AMD zu erkranken. Untersucht wurde die Genexpression des Komplementfaktors C9 unter verschiedenen pathologischen Bedingungen in humanen retinalen Pigmentepithel (RPE)-Zellen sowie deren Wirkung auf die physiologischen Eigenschaften der Zellen. Gezeigt wird, dass die Expression des C9 Gens in humanen RPE-Zellen spezifisch durch Hyperosmolarität, Hypoxie und oxidativen Stress induziert wird. Die Menge an C9 Protein wurde durch Hyperosmolarität leicht aber signifikant erhöht. Die hyperosmotische Induktion der C9 mRNA ist abhängig von der Aktivierung der Signalproteine p38 MAPK, ERK1/2, JNK, PI3K, sowie der Transkriptionsfaktoren STAT3 und NFAT5 während für die Hypoxie-induzierte C9 mRNA Expression nur eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors STAT3 nachgewiesen wurde. Die Aktivierung verschiedener Signalwege durch Hyper-osmolarität und Hypoxie lässt vermuten, dass eine hohe Kochsalzaufnahme auch unter normoxischen Verhältnissen die Eigenschaften RPE-Zellen verändert. Hyperosmolarität hemmt die Proliferation und Migration der RPE-Zellen, während chemische Hypoxie nur die Proliferationsrate verringert. Die Wirkung einer erhöhten extrazellulären NaCl-Konzentration auf die C9 mRNA Expression wird über zwei Mechanismen vermittelt: über die Erhöhung der extrazellulären Osmolarität und über die Veränderung des NaCl-Gradienten über der Plasmamembran. Die NaCl Wirkung über den veränderten NaCl-Gradienten lässt vermuten, dass eine übermäßige Aufnahme von Kochsalz nicht nur über die Erhöhung des Blutdruckes die Pathogenese der AMD stimuliert, sondern dass Kochsalz auch eine direkte stimulierende Wirkung auf RPE-Zellen besitzt. Diese Vermutung könnte erklären, weshalb hoher Blutdruck ein Risikofaktor der AMD ist, aber Medikamente zur Behandlung des Bluthochdruckes das Risiko der AMD nicht verändert.:Inhaltsverzeichnis Bibliographische Beschreibung IV Abkürzungsverzeichnis V 1. EINLEITUNG 1 1.1. Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1 1.2. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) 2 1.2.1. Die atrophe AMD 3 1.2.2. Die exsudative AMD 4 1.2.3. Die Aktivierung des Komplementsystems bei der exsudativen AMD 5 1.3. Risikofaktoren der AMD 7 1.4. Einfluss von Hypertonie auf die AMD 9 1.4.1. Hypertonie 9 1.4.2. Hypertonie als Risikofaktor der AMD 10 1.5. Therapie der AMD 11 2. FRAGESTELLUNG 13 3. MATERIAL UND METHODEN 14 3.1. Arbeitsmaterialien 14 3.1.1. Substanzen 14 3.1.2. Medien 15 3.1.3. Kits 15 3.1.4. Primer 16 3.1.5. Längenstandards 16 3.1.6. Antikörper 16 3.1.7. Rekombinante humane Proteine 17 3.1.8. Selektive Hemmer 17 3.1.9. Geräte 17 3.2. Zellbiologische Methoden 19 3.2.1. Zellkultivierung 19 3.2.2. Zellstimulation 20 3.2.3. Bestimmung der Proliferationsrate 21 3.2.4. Zellmigration 22 3.3. Molekularbiologische Methoden 23 3.3.1. RNA-Präparation 23 3.3.2. RNA Quantifizierung 24 3.3.3. cDNA-Synthese 24 3.3.4. Real-Time PCR 24 3.3.5. Agarose-Gel-Elektrophorese 26 3.3.6. Untersuchungen mit short interfering (si) RNA 27 3.4. Immunologische Methoden 28 3.4.1. Western Blot 28 3.4.1.1. Extraktherstellung aus RPE-Zellen 28 3.4.1.2. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford 29 3.4.1.3. SDS-Gelektrophorese 30 3.4.1.4. Western Blot 32 3.5. Statistische Auswertung 33 4. ERGEBNISSE 34 4.1. Regulation der Genexpression von Komplementfaktoren in RPE-Zellen 34 4.1.1. Hyperosmolarität erzeugt durch NaCl 34 4.1.2. Hyperosmolarität erzeugt durch Sucrose 36 4.1.3. Wirkung von Hypoosmolarität und oxidativem Stress 37 4.1.4. Wirkung von Hypoxie 38 4.1.5. Gemeinsame Wirkung von CoCl2 und NaCl 38 4.1.6. Wirkung von Zytokinen 39 4.1.7. Wirkung von Serum- und Gerinnungsfaktoren sowie Glukose 40 4.1.8. Wirkung von Entzündungsmediatoren 40 4.1.9. Wirkung von Matrixmetalloproteinase und Triamcinolon 41 4.2. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Transkription und die Stabilität der C9 mRNA 42 4.3. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der Induktion der C9 mRNA unter Hyperosmolarität und Hypoxie in RPE-Zellen 43 4.3.1. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der NaCl-induzierten C9 mRNA Expression in RPE-Zellen 43 4.3.2. Hyperosmolare Induktion der C9 mRNA: Einfluss des Transkriptionsfaktors NFAT5 44 4.3.3. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der Hypoxie-induzierten C9 mRNA Expression bei RPE-Zellen 46 4.4. Aktivierung intrazellulärer Signalproteine durch Hyperosmolarität bzw. Hypoxie 47 4.5. Wirkung von Hyperosmolarität auf das C9 Protein 48 4.6. Wirkung von Hyperosmolarität auf die physiologischen Eigenschaften der RPE- Zellen 50 4.6.1. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Zellproliferation 50 4.6.2. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Zellmigration 51 4.6.3. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Zellvitalität 51 5. DISSKUSION 53 5.1. Wirkung von Hyper-, Hypoosmolarqität, Hypoxie und oxidativem Stress auf die Genexpression von C9 in humanen RPE-Zellen 53 5.3. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Stabilität der C9 mRNA 56 5.4. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der NaCl- bzw. CoCl2-induzierten C9 mRNA Expression in RPE-Zellen 56 5.5. Einfluss des Transkriptionsfaktors NFAT5 auf die hyperosmolare C9 Induktion 58 5.6. Aktivierung intrazellulärer Signalproteine durch Hyperosmolarität bzw. Hypoxie 58 5.7. Wirkung von Hyperosmolarität auf das C9 Protein 59 5.8. Wirkung des Komplementfaktors C9 und der Hyperosmolarität auf die physiologischen Eigenschaften von RPE-Zellen 60 5.8.1. Wirkung auf die Zellproliferation 60 5.8.2. Wirkung auf die Zellmigration 60 5.8.3. Wirkung auf die Zellvitalität 61 5.9. Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der AMD 61 6. ZUSAMMENFASSUNG 63 7. LITERATURVERSZEICHNIS 68 8. TABELLENVERZEICHNIS 85 9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 86 10. ANHANG 88 10.1. Eigenständigkeitserklärung 88 10.2. Lebenslauf 89 10.3. Danksagung 9