Expression diagnostisch verwendbarer Antigene zum Nachweis West-Nil-Virus-spezifischer Antikörper: Expression diagnostisch verwendbarer Antigene zum NachweisWest-Nil-Virus-spezifischer Antikörper

Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate. Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich. Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.:Inhaltsverzeichnis Bibliografische Darstellung V Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis IX Tabellenverzeichnis X Formelverzeichnis XII 1 Einleitung 1 1.1 West-Nil-Virus: Relevanz und epidemiologische Aspekte 1 1.2 Virale Struktur und Replikation 3 1.3 West-Nil-Virus-Erkrankung: Prädiktion, Pathogenese und Krankheitsbild 7 1.4 Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 9 1.5 Zielstellung 12 2 Materialien 13 2.1 Versuchstiere, Bakterien-, Hefe- und Virusstämme 13 2.2 Vektoren und Oligonukleotide 13 2.3 Reagenzsysteme, Standards und Enzyme 15 2.4 Antikörper 16 2.5 Feinchemikalien und Reagenzien 16 2.6 Puffer und Lösungen 19 2.7 Nährmedien 20 2.8 Verbrauchsmaterialien und Technische Ausstattung 21 3 Methoden 25 3.1 Molekularbiologische Methoden 25 3.1.1 Reverse Transkription 25 3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 25 3.1.3 DNA-Sequenzierung 28 3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese 28 3.1.5 DNA-Reinigung 29 3.1.6 Bestimmung der DNA-Konzentration 29 3.1.7 Restriktionsverdau 29 3.1.8 Ligation 30 3.2 Arbeiten mit E. coli 31 3.2.1 Kultivierung und Lagerung 31 3.2.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 31 3.2.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli-Zellen 31 3.2.4 Plasmidpräparation aus E. coli 31 3.2.5 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 32 3.3 Arbeiten mit P. pastoris 32 3.3.1 Kultivierung und Lagerung 32 3.3.2 Herstellung kompetenter P. pastoris-Zellen 32 3.3.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente P. pastoris-Zellen 33 3.3.4 Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris 33 3.4 Biochemische Methoden 34 3.4.1 Proteinextraktion aus Bakterienzellen 34 3.4.2 Proteinextraktion aus Hefezellen 35 3.4.3 Proteinfällung mittels Trichloressigsäure (TCA) 35 3.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 35 3.4.5 Silberfärbung 37 3.4.6 Western Blot 37 3.4.7 Reinigung der rekombinanten Polypeptide aus Proteingemischen 38 3.4.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 40 3.4.9 Spaltung von MBP-Fusionsproteinen 40 3.4.10 Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) 41 3.4.11 Immunisierung der Balb/c-Mäuse 42 3.4.12 Indirekter ELISA 43 3.4.13 Bestimmung des murinen Antikörpertiters 44 3.4.14 Nachweis humaner Antikörper im Testserum 45 4 Ergebnisse 46 4.1 Definition der ausgewählten Strukturproteinsequenzen 46 4.2 Expression der rekombinanten Polypeptide prM, Cnat und Cme in P. pastoris 47 4.2.1 Klonierung der Expressionsplasmide 47 4.2.2 Transformation von Pichia pastoris 49 4.2.3 Expression der Zielpeptide in P. pastoris 51 4.3 Expression von Cnat und Cme in E. coli 56 4.3.1 Klonierung der Expressionsplasmide 56 4.3.2 Transformation von E. coli 58 4.3.3 Expression der WNV-Sequenzen Cnat und Cme als Fusionsproteine 59 4.3.4 Spaltung der Fusionsproteine mittels Faktor Xa 62 4.3.5 Isolierung der Zielpeptide Cnat und Cme 63 4.4 Untersuchung der Immunogenität der rekombinanten WNV-Polypeptide 66 4.4.1 Immunisierung von Versuchstieren mit rekombinanten WNV-Polypeptiden 66 4.4.2 Analyse der murinen Seren mittels ELISA 66 4.4.3 Erweiterte Analyse des rekombinanten prM-Polypeptids mit Humanseren 67 4.4.4 Erweiterte Analyse der murinen prM-Seren im IFT 69 4.5 Prüfung der rekombinanten Peptidantigene auf ihre Verwendbarkeit in einem WNV-spezifischen Testsystem 69 4.5.1 Untersuchung der humanen Seren S2-S42 mittels ELISA 69 4.5.2 Einsatz von Cnat und MBP-Cme als Antigene zur Untersuchung der humanen Seren S2-S42 im ELISA 70 5 Diskussion 72 5.1 Expression von prM, Cnat und Cme in P. pastoris 73 5.2 Expression von Cnat und Cme in E. coli 77 5.3 Analyse der Immunogenität von prM, Cnat und MBP-Cme 79 5.4 Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA für die Detektion WNV-spezifischer Antikörper in humanen Serumproben 84 6 Zusammenfassung 90 7 Literaturverzeichnis 94 8 Anhang 104 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XIV Danksagung XV Lebenslauf XV