Investigations of Cellular Communication and Cytoskeleton in Bovine Embryos after Zona-free Somatic Cell Nuclear Transfer

Neben der Aufgabe, die „Hand-Made“ Klonierungstechnik (HMCTM) erfolgreich in unserem Labor einzuarbeiten, wurden Untersuchungen zur Entwicklungskompetenz und Lebensfähigkeit von Embryonen aus HMCTM durchgeführt. Dabei wurden verschiedene somatische Zellen als Kernspender verwendeten und die Verteilungsmuster von Zytoskelettproteinen (a-Tubulin und F-Actin), die Eigenschaften interzellulärer Kontakte sowie das Auftreten des „Gap-Junction-Proteins Connexin 43 zwischen HMCTM-Embryonen als auch mittels IVP und in vivo produzierte Embryonen verglichen. Die durchschnittliche Gesamteffizienz des Verfahrens lag bei 95% rekonstruierter Embryonen mit 65% mittlerer Teilungsrate. Keine signifikanten Unterschiede wurden zwischen den drei Gruppen von somatischen Zellen in bezug auf Embryorekonstruktionseffizienz, Teilungsrate, Anzahl von >8 Zell Embryonen und Blastozystenrate beobachtet. Von den erzeugten Embryonen erreichten nur 2% das Blastozystenstadium. Viele Embryonen verharrten arretiert zwischen dem 8 und 16 Zell Stadium, was dem Zeitpunkt der Umschaltung vom maternalen auf das embryonale Genom entspricht (TELFORD et al. 1990; MEMILI et al. 1998). Wir erzeugten insgesamt 67 übertragbare Blastozysten von denen 36 auf synchrone Rezipienten transferiert wurden. Die erzeugten 6 Trächtigkeiten entsprechen einer Rate von 17%. Funf Trächtigkeiten gingen verloren und eine führte zur Geburt eines Bullenkalbes - des ersten HMCTM Kalbes in Europa. Die Etablierung der HMCTM Technik in unserem Laboratorium kann damit als erfolgreich betrachtet werden. Die höchste Intensität der a-Tubulinfärbung wurde in klonierten und IVP-Embryonen (ohne signifikante Unterschiede) festgestellt. Im Unterschied dazu war sie in in vivo erzeugten Embryonen signifikant geringer, was auf die möglicherweise ungünstigen Einflüsse der In-vitro-Kulturbedingungen hinweist. Für Actin wurde eine höhere Intensität in in vivo- und IVP-Embryonen (ohne signifikante Unterschiede) festgestellt, während sie in klonierten Embryonen signifikant niedriger war. Das weist auf einen negativen Effekt der Zona pellucida freien HMCTM Methode hin, die für den Kerntransfer verwendet wurde. Spekulativ können die Abweichungen, die in der Verteilung der Zytoskelettproteine beobachtet wurden, als ein Anzeichen für den Entwicklungsblock in den betroffenen Rinderembryonen betrachtet werden (MATSUMOTO et al. 2002). Untersuchungen mittels Western-Blot ergaben, dass in IVP-Embryonen vom 4-Zellstadium bis zum Morulastadium sowohl Connexin-43 als auch a-Tubulin ohne quantitative Unterschiede nachweisbar waren. 8-Zellembryonen aus HMCTM, IVP und in vivo Produktion im Vergleich, zeigten ebenfalls keine quantitativen Unterschiede bezüglich Connexin-43 und a-Tubulin. Diese Ergebnisse entsprechen einer früheren Hypothese das Cx43 Transkripte in in vitro produzierten Rinderembryonen maternalen und embryonalen Ursprungs sein können (WRENZYCKI et al. 1996). Die Ultrastrukturanalyse von 8-Zellembryonen zeigte dass die interzellularen Kontakte zwischen den Blastomeren in bezug auf ihre Länge in HMCTM Embryonen die kürzesten Kontaktzonen (CP) und in in vivo produzierten Embryonen die längsten CP aufwiesen. Während der Abwesenheit von Gap-Junctions (GJ) in den früheren Stufen der Embryogenese können diese CPs eine entscheidende Rolle beim Transfer von Metaboliten zwischen den Zellen und bei der interzellulären Kommunikation bis zum späten Morula- oder frühen Blastozystenstadium, wenn die GJ Bildung einsetzt, übernehmen. Die kürzere CP Länge kann deshalb einer der Gründe für die relativ schlechtere Entwicklungsrate der klonierten Embryonen sein. Detailliertere Untersuchungen zur Bedeutung der Länge der CPs'' und ihren funktionellen Aspekten werden zukünftig nötig, um eine genauere Interpretation zu ermöglichen.Apart from the aim of successfully establishing the Handmade cloning (HMCTM) technique in our laboratory, investigations were conducted to study the developmental competence and viability of the HMCTM -derived embryos while using different somatic cells, and to compare the distribution pattern of cytoskeletal proteins (alpha-tubulin and F-actin) and the nature of cellular contacts, as also the presence of Connexin 43 (gap junction protein) between HMCTM cloned, IVP and in vivo produced embryos. We obtained a 95 % overall average efficiency of formation of the reconstructed embryos with a 65 % average cleavage rate. No significant differences were observed between the three groups of somatic cell donors in terms of embryo reconstruction efficiency, cleavage rate, number of > eight cell stage embryos, and the blastocyst rates. Of the fused couplets, only 2 % reached the blastocyst stage, with many of the embryos arresting between the 8- to 16-cell stage, a stage corresponding to the timing of maternal to embryonic genomic take-over of development in bovine (TELFORD et al. 1990; MEMILI et al. 1998). We also recovered a total of 67 transferable blastocysts, out of which 36 blastocysts were transferred to 36 synchronized recipients resulting in six pregnancies, thereby yielding a 17 % pregnancy rate. Five pregnancies were lost from abortions and one resulted in the birth of a bull calf - the first HMCTM calf born in Europe. The establishment of the HMCTM technique in our lab can thus be regarded as successful. The maximum intensity of tubulin was observed in the cloned and the IVP embryos (with no significant differences) whereas it was significantly lower in the in vivo embryos indicating the adverse effects of in vitro culture conditions. In the case of actin, a higher intensity of staining was observed in the case of in vivo and IVP embryos (with no significant differences) whereas the same was significantly lower in the cloned embryos thereby reflecting the adverse effects of the zona-free technique used in the HMCTM method of SCNT. Speculatively, the deviations/variations observed in the distribution of the cytoskeletal proteins may be an indicator of the developmental arrest in the bovine embryos concerned (MATSUMOTO et al. 2002). Western blot analysis revealed that in the IVP embryos, from 4-cell stage up to the morula stage, both connexin-43 and tubulin were present with no quantitative differences. The 8-cell stage embryos collected from HMCTM cloning, IVP and in vivo production also showed presence of connexin-43 and tubulin, yet again, with no quantitative differences. The results could conform to an earlier hypothesis that Cx43 transcripts in bovine embryos produced in vitro might be of maternal and embryonic origin (WRENZYCKI et al. 1996). Ultrastructural analysis of the 8-cell stage embryos showed that the intercellular contacts between the blastomeres were, in terms of length, of the shortest order in case of the HMCTM cloned embryos whereas these Contact Point (CP) lengths were of the greatest order in vivo produced embryos. In the absence of gap junctions (GJ) in the earlier stages of embryogenesis, these CPs may play a crucial role in the exchange of metabolites and cell-to-cell communication till the late morula or early blastocyst stage when the GJ formation occurs. The shorter CP length may, therefore, be one of the reasons for the relative poor development rate of the cloned embryos. Detailed investigations of the significance of the length of the CPs and their functional aspects would be required in future to facilitate meaningful interpretation