Development of Nanobodies to Image Synaptic Proteins in Super-Resolution Microscopy

Die Entwicklung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie hat in den vergangenen Jahrzehnten substanziell zur Erforschung subzellulärer Strukturen beigetragen. Als ein bekanntes Beispiel kann hier die molekulare Organisation der neuronalen Synapse angeführt werden, deren Integrität für die neuronale Reizweiterleitung unerlässlich ist. Synapsen enthalten eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine, die auf molekularer Ebene in fein abgestimmten Mechanismen interagieren, um die synaptische Funktion zu gewährleisten. Die hochauflösende Untersuchung solcher Proteine im Nanometer-Bereich kann daher wertvolle Informationen über synaptische Mechanismen liefern. Es ist dabei unerlässlich, jene synaptischen Proteine mit einer Markierung zu versehen, um sie in mikroskopische Studien zu identifizieren. Üblicherweise werden hierzu Antikörper genutzt um mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezielt zelluläre Antigene zu untersuchen. In jüngsten Studien wurde jedoch gezeigt, dass einige Eigenschaften von Antikörpern von Nachteil für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie sind. Hierzu zählen unter anderem ihre vergleichsweise große räumliche Ausdehnung und das zweiwertige Binden ihrer Antigene. Einen Gegensatz hierzu bilden minimale Sonden, wie beispielweise Nanokörper, da sie nicht die genannten Nachteile von Antikörpern aufweisen. Nanokörper stellen Einzeldomänenfragmente dar, die aus einem speziellen Antikörper-Subtyp ohne leichte Ketten isoliert wurden. Sie zeichnen sich insbesondere durch hohe thermodynamische Stabilität aus und können in skalierbaren Mengen aus bakteriellen Expressionssystemen isoliert werden. Im Rahmen dieses Projektes wurden zwei neue Nanokörper beschrieben, die spezifisch und mit hoher Affinität an die beiden synaptische SNARE Proteine SNAP 25 und syntaxin 1A binden. Die Nanokörper wurde anschließend genutzt, um diese Proteine mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die mikroskopische Beobachtung mittels Nanokörpern signifikant von jenen abweicht, die mittels primären und sekundären Antikörpern gemacht wurden. Des Weiteren weisen die Nanokörper mehrere Vorteile gegenüber konventionellen Antikörpern auf. Hierzu zählen beispielweise eine erhöhte Gewebepenetration, eine erhöhte Dichte von detektierten Antigenen und die Vermeidung artifizieller Clusterbildung. Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass Nanokörper vielseitige Werkzeuge sind, um mittels mikroskopischer Methoden kleine and komplexe biologische Strukturen, wie beispielsweise Synapsen, zu untersuchen. Nanokörper tragen daher durch die erhöhte Präzision in abbildenden Verfahren schlussendlich auch zu einer Verbesserung der Auflösung bei.In the recent decades, super resolution microscopy substantially contributed to the investigation of subcellular structures. A prominent example is the molecular organization of the synapse which is known to be vital for neuronal signal transmission. Synapses contain a plethora of different proteins which interact in fine-tuned mechanisms on molecular level to provide synaptic function. The observation of those proteins at nanoscale resolution thus provides important information on synaptic mechanisms. To identify different synaptic proteins they need to be marked with a label, which can be used for detection in microscopy. Commonly, antibodies are used in immunofluorescence microscopy to specifically detect target antigens. However in recent studies, antibodies have been shown to exhibit several drawbacks in super-resolution imaging, primarily imposed by their comparable large size and divalent nature. In contrast, small probes such as nanobodies gain increasing interest in the field of molecular imaging as they bypass several drawbacks of antibodies. Nanobodies are single-domain binders derived from an antibody subtype devoid of the light chain. They show high thermodynamic stability and can be produced in scalable amounts using bacterial expression systems. In this project, I selected and characterized two novel nanobodies binding with high affinity and specificity two neuronal SNARE proteins, SNAP 25 and syntaxin 1A. The nanobodies were subsequently used in immunofluorescence microscopy to investigate the organization of these proteins in super resolution. I found that the obtained fluorescence image using nanobodies significantly differs from the stainings observed if primary and secondary antibodies are used. Furthermore, the obtained nanobodies show several advantages over conventional antibodies including increased tissue penetration, detection of more epitopes and the absence of artificial clustering effects. Taking together the findings, I conclude that nanobodies are versatile tools for super-resolution microscopy to study small but complex biological structures such as synapses. The small size and biochemical properties of nanobodies direct the fluorophore in direct proximity to the antigen. This eventually also increases the attainable resolution and thus to the amount of detail observed in microscopy