Um papel da tradução local nos terminais pré-sinápticos

Tese de Doutoramento em MedicinaMechanisms of on-site protein production allow rapid subcellular responses to extracellular stimuli. This is especially relevant in polarized cells, such as neurons. During development, neurons extend axons to specific target areas and form an intricate network of connections, fundamental for nervous system function. Both axonal navigation and synapse formation are extremely fast processes that depend on target-derived cues. While local translation is important in regulating many aspects of axonal pathfinding, its role in presynaptic assembly is poorly understood. We established that local translation is very rapidly induced in isolated axons upon contact with synaptogenic adhesive substrates. We were able to detect newly synthesized proteins within 15 minutes of contact and inhibiting protein synthesis interfered with the specific clustering of presynaptic proteins at contact sites. We found that the transcript for the t-SNARE protein SNAP25, required for vesicle exocytosis, localizes to axons and clusters around presynaptic specializations and we were able to directly visualize SNAP25 synthesis at these sites. We further demonstrated that inhibiting axonal SNAP25 synthesis interferes with presynaptic protein clustering and synaptic vesicles release dynamics. This project uncovered a fundamental role for intra-axonal SNAP25 synthesis during synaptic terminal assembly. Furthermore, we have implicated local translation defects in delayed functional consequences, which opens up new possibilities relevant for the study of neurodevelopmental disorders.Mecanismos de produção local de proteínas permitem respostas rápidas e compartimentalizadas a estímulos extracelulares. E são especialmente relevantes em células polarizadas, como neurónios. Durante o desenvolvimento, os neurónios projetam axónios para áreas específicas e formam uma rede de conexões, fundamental para o funcionamento do sistema nervoso. Tanto a navegação axonal como a formação sináptica são processos extremamente rápidos que dependem de sinais extracelulares derivados das células alvo. A tradução local é importante para muitos aspetos da navegação axonal, mas o seu papel na formação sináptica ainda não é bem conhecido. Usámos um substrato adesivo para induzir diferenciação sináptica em axónios isolados e estabelecemos que a tradução local é rapidamente ativada após o contato. Conseguimos marcar e detetar proteínas sintetizadas de novo 15 minutos após o contato e a inibição da síntese proteica interferiu com a acumulação específica de proteínas pré-sinápticas nos locais de contacto. Mostrámos que o mRNA da proteína SNAP25, envolvida na exocitose de vesículas, é transportado para os axónios e acumula-se em torno das especializações pré-sináticas e conseguimos ainda visualizar diretamente a síntese de SNAP25 nestes locais. Mostrámos que a inibição da síntese axonal de SNAP25 afeta a acumulação de proteínas pré-sináticas e interfere com a exocitose de vesículas sinápticas. Com este projeto demonstrámos que a síntese axonal de SNAP25 desempenha um papel fundamental na formação do terminal pré-sináptico. Adicionalmente, mostrámos que efeitos na tradução local podem ter consequências funcionais tardias, o que gera novas hipóteses de relevo no estudo de doenças do desenvolvimento.The work on this thesis was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) in the context of the FCT funded University of Minho MD/PhD Program (SFRH/BD/52322/2013); and by grants from the National Institutes of Health (R01MH096702), the BrightFocus Foundation, and the Irma T. Hirschl (Ulrich Hengst)