马氏珠母贝硫酸软骨素合成酶基因1（ChSy-1）的克隆及功能研究

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是普遍存在于动物软骨组织中的一类重要的酸性高分子粘性多糖，其基于其精细的生物学结构发挥着许多生理功能，它的合成受到六种合成酶的调控，其中相关研究已经表明，在这六种酶中，ChSy-1在CS主链的合成以及糖链的延伸上起到非常重要的作用，当其缺失或突变时，小鼠、斑马鱼和人类都会出现相关的病症。目前对于ChSy-1的研究主要集中在人类群体以及模式动物中，在贝类中还未有相关报道。马氏珠母贝又称合浦珠母贝（Pinctada fucata，P.fucata），属于软体动物门，瓣腮纲，珍珠贝目，珍珠贝科，珠母贝属，是生产海水珍珠的主要母贝。本论文根据已有的马氏珠母贝转录组，进行ChSy-1的克隆和功能研究，为深入开展ChSy-1在马氏珠母贝中的功能奠定基础。 硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是普遍存在于动物软骨组织中的一类重要的酸性高分子粘性多糖，其基于其精细的生物学结构发挥着许多生理功能，它的合成受到六种合成酶的调控，其中相关研究已经表明，在这六种酶中，ChSy-1在CS主链的合成以及糖链的延伸上起到非常重要的作用，当其缺失或突变时，小鼠、斑马鱼和人类都会出现相关的病症。目前对于ChSy-1的研究主要集中在人类群体以及模式动物中，在贝类中还未有相关报道。马氏珠母贝又称合浦珠母贝（Pinctada fucata，P.fucata），属于软体动物门，瓣腮纲，珍珠贝目，珍珠贝科，珠母贝属，是生产海水珍珠的主要母贝。本论文根据已有的马氏珠母贝转录组，进行ChSy-1的克隆和功能研究，为深入开展ChSy-1在马氏珠母贝中的功能奠定基础。 2. 组织表达分析表明，ChSy-1基因在马氏珠母贝的外套膜、闭壳肌、肝胰腺、足、性腺、鳃、心脏中均有表达；在不同发育时期，ChSy-1基因则是在极体期、2细胞期和32细胞期表达量较高。 3. 进行了活体免疫刺激实验以及插核实验，探究ChSy-1在免疫中的功能。免疫刺激实验结果表明，在注射了脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（Poly I:C）两种免疫刺激物之后，ChSy-1的表达量在肝胰腺中，LPS组在12h和72h后与对照组有显著差异（p < 0.05），Poly I:C组在12h和48h后与对照组有显著差异（p < 0.05）；在外套膜中，ChSy-1的表达量在LPS组48h和72h后与对照组有极显著差异（p < 0.01），Poly I:C组在24h、48h和72h后与对照组有显著差异（p < 0.05）。在进行插核后，在血淋巴中，ChSy-1在第3、5和第7天表达量与第一天相比有了显著差异（p < 0.05）；在肝胰腺中，ChSy-1在第3天和第7天表达量与第一天相比有了显著差异（p < 0.05），说明ChSy-1参与了马氏珠母贝的免疫应答反应。 4. 在矿化功能研究中，检测了ChSy-1在外套膜不同部位的mRNA表达量，结果发现ChSy-1基因在马氏珠母贝的外套膜三个部分都有较高的表达，且三者间并无显著性差异（p > 0.05），推测其在马氏珠母贝棱柱层和珍珠层的生物矿化过程中都有重要的作用。缺刻实验中，ChSy-1在马氏珠母贝缺刻后在外套膜中的表达量呈显著的上升趋势，说明其参与了壳损伤后的修复过程。BMP2基因RNA干扰后，ChSy-1基因的表达量与对照组比较，有了极显著上升（p < 0.01）。已有研究证明BMP2可以影响壳的生物矿化进程，本实验中对BMP2基因成功干扰后，ChSy-1在外套膜中的表达量显著上升，说明ChSy-1参与了影响生物矿化的BMP信号通路