Etude de l'impact de la dérégulation transcriptionnelle liée à des transcrits chimères initiés à partir d'éléments répétés de type LINE-1 dans la tumorigenèse gliale

LINE-1 (L1) is the most abundant class of retrotransposons which represents 17% of the human genome. The 5’ region of the youngest L1 sub-families (L1PA1 to 6) contains a bidirectional promoter consisting, in addition to the internal sense promoter, of an antisense promoter, called ASP. In normal cells, the main defense mechanism, developed to counteract the deleterious effect of L1 activity, consists in L1 promoter DNA methylation. A hallmark of cancer genomes consists in a global DNA hypomethylation which affects especially L1 promoters. In tumors, evidences suggest that this hypomethylation could result in transcription from ASP of aberrant L1-Chimeric Transcripts (LCTs) composed of L1 5’end and its adjacent sequence. To investigate the pangenomic extent of this transcriptional deregulation and its impact in tumoral processes, a dedicated bioinformatic tool, CLIFinder, was designed to select putative LCTs among RNA-seq oriented paired-end reads. RNA-seq analyses of 13 gliomas, which are the most common brain cancer in adults, and 3 control brains were performed.CLIFinder identifies 2675 chimeras in gliomas, among which 84% involves recent L1 (PA1 to 7) full size, supposed to possess a functional ASP, and 50% are detected specifically in tumors samples. 78 chimeras correspond to LCT already described in literature. In addition, study of additional RNA-seq data from other tumor types (MCF7 and ovarian metastasis) by CLIFinder identifies common chimeras suggesting that some of them can be recurrent. The analysis of a group of chimeras by 5’ walk RT-PCR validate that 89% (56/63) of chimeras implying recent L1 (L1PA1 to 7) are initiated at the ASP region and therefore correspond to LCT; whereas all tested chimeras implying an L1PA8 element are transcribed from an upstream region. RT-qPCR studies on a larger cohort of 51 gliomas show that all 56 tested LCT, even identified by CLIFinder as “tumor specific”, are not only expressed in tumors but also in controls. Nevertheless, 70% of the “tumor specific” LCTs are significantly overexpressed in tumors. My results suggest that, even L1 5’ UTR methylation, some ASP are active in normal tissues and lead to a basal LCT expression in normal tissues. Moreover, a transcriptional deregulation linked to LCTs in tumors exists and implies a LCTs’ overexpression.In order to determine the underlying mechanisms involved in the increase of transcriptional activity of ASP, two hypothesis were tested. The first one implies L1 promoter hypomethylation. My results tend to refute this hypothesis because no decrease of the DNA methylation is found at the promoter region of L1 linked to overexpressed LCTs. On the other hand, the genes associated to LCT presenting an expression deregulation in tumors demonstrate a deregulation in the same way. Moreover, gene expression variations correlates systematically with the one corresponding LCTs. This suggests that an increase of transcriptional activity at the LCTs loci would be responsible of their overexpression. Finally, 2 candidate LCT overexpressed and presenting as potential predictive biomarkers for patient’s survival, could play a functional role in initiation, progression and/or the tumoral aggressiveness.In conclusion, my work has validated CLIFinder as a useful tool to identify, at pangenomic level, LCTs expressed in different tumor types from paired-end stranded RNA-seq data. The observation of the recurrence and tumoral overexpression for some LCTs suggests that they may play a functional role in tumoral processes.Les éléments LINE-1 (L1) sont une classe abondante de rétrotransposons représentant 17% du génome humain. La région 5’UTR des sous-familles les plus récentes (L1PA1 à 6) contient un promoteur bidirectionnel contenant non seulement un promoteur sens interne mais aussi un promoteur antisens, nommé ASP. Dans les cellules normales, l’un des mécanismes impliqués dans la régulation du promoteur de L1 est la méthylation ADN. Dans les tumeurs, une hypométhylation globale affectant notamment les L1 est observée. Il a été mis en évidence que cette hypométhylation pouvait induire la transcription, à partir de l’ASP, de transcrits chimères ou LCT (L1 Chimeric Transcript). Ces LCT sont composés en 5’ de la séquence L1 et se poursuivent dans la région génomique adjacente. Afin d’étudier l’impact pangénomique de cette dérégulation et son implication dans les processus tumoraux, un outil bio-informatique dédié, nommé CLIFinder, a été développé pour identifier dans des données de RNA-seq paired-end orientés des LCT putatifs. Les RNA-seq de 13 gliomes, qui sont les cancers du cerveau les plus fréquents chez l’adulte, et de 3 tissus cérébraux contrôles ont été étudiés. CLIFinder identifie 2675 chimères dans les gliomes dont 84% impliquent des L1 récents (PA1 à 7) pleine taille supposés posséder un ASP fonctionnel et 50% sont détectées spécifiquement dans les échantillons tumoraux. 78 chimères correspondent à des LCT déjà décrits dans la littérature. De même, l’étude de RNA-seq d’autres types tumoraux (lignée MCF7 et métastases ovariennes) par CLIFinder identifie des chimères en commun suggérant une récurrence de certaines d’entre elles. L’étude d’un groupe de chimères par marche en 5’ par RT-PCR valide que 89% (56/63) des chimères impliquant des L1 récents (L1PA1 à PA7) sont initiées dans la région de l’ASP et correspondent à des LCT alors que toutes les chimères testées impliquant des L1PA8 sont initiées en amont de cette région. Des études de RT-qPCR sur une cohorte plus large de 51 gliomes montrent que les 56 LCT testés, incluant des LCT spécifiques de tumeurs, sont exprimés non seulement dans les tumeurs mais aussi dans les contrôles. Par contre, 70% des LCT spécifiques de tumeurs, montrent alors une surexpression tumorale significative. Ces résultats suggèrent donc une transcription basale provenant de l’ASP dans les tissus normaux et que la dérégulation transcriptionnelle liées aux LCT dans les gliomes passe par une surexpression. Par ailleurs, afin de déterminer le ou les mécanismes sous-jacents impliqués dans l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de l’ASP, deux hypothèses ont été testées. La première implique l’hypométhylation du promoteur de L1. Toutefois mes résultats tendent à réfuter cette hypothèse puisqu’aucune diminution de la méthylation ADN n’est retrouvée au niveau de la région promotrice des L1 impliqués dans la transcription de LCT surexprimés. Par contre, les gènes associés à des LCT dont l’expression est dérégulée en contexte tumoral présentent une dérégulation dans le même sens que celle du LCT. De plus, les variations d’expression de gènes corrèlent systématiquement avec celle des LCT correspondants. Ceci suggère qu’une augmentation d’activité transcriptionnelle aux loci des LCT serait responsable de la surexpression de ceux-ci. Enfin 2 LCT candidats surexprimés et ayant un potentiel de biomarqueur prédictif de la survie des patients, pourraient jouer un rôle fonctionnel dans l’initiation, la progression et/ou l’agressivité tumorale. En conclusion, mes travaux ont validé que CLIFinder se positionne comme un outil pertinent permettant d’identifier, de façon pangénomique, les LCT exprimés dans différents types tumoraux à partir de données de RNA-seq paired-end orientées. L’observation d’une récurrence ainsi que d’une surexpression tumorale de certains LCT suggère qu’ils pourraient jouer un rôle fonctionnel dans les processus de tumorigenèse