Der Einfluss des zellulären Metabolismus auf die cAMP-regulierte Umverteilung des Wasserkanals Aquaporin-2 in Hauptzellen der Niere

One of the main effectors of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is the ubiquitously expressed serine/threonine protein kinase, cAMP-dependent protein kinase (PKA). Binding of cAMP to the regulatory subunits of PKA results in a conformational change and the release of the catalytic subunits to phosphorylate nearby targets. To ensure spatially and temporally controlled phosphorylation of a subset of its substrates, PKA is tethered to intracellular compartments by A-kinase anchoring proteins (AKAPs). Around 50 different AKAPs have been described that compartmentalize PKA signalling in various cell types. Canonical AKAPs share a consensus PKA binding motif, which encompasses hydrophilic anchor points that were recently identified by our group. The results of this thesis show that the constituent amino acids are crucial for PKA binding. Detailed knowledge of the AKAP-PKA interaction site will help to develop AKAP-specific strategies for pharmacological interference. A pathway that requires AKAP-controlled PKA activity is the antidiuretic hormone arginine-vasopressin (AVP)-regulated water reabsorption from primary urine in the kidneys collecting duct. Binding of AVP to its receptor on the surface of renal principal cells causes intracellular cAMP elevation, PKA activation and translocation of the water channel aquaporin-2 (AQP2) from intracellular vesicles into the plasma membrane. The insertion of AQP2 increases the water permeability of the distal part of the nephron, which enables fine-tuning of body water homeostasis. The molecular pathways that underlie controlled AQP2 redistribution are only partially understood. Especially the metabolic control of the vesicle transport is still unknown. In this thesis, a global metabolic analysis of primary inner medullary collecting duct (IMCD) cells shows that AVP stimulation does not modulate major metabolic pathways. Yet, identification of the metabolic enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and the metabolic sensors AMP-activated kinase (AMPK) and vacuolar H+-ATPase (V-ATPase) on AQP2-bearing vesicles indicates local metabolic control of AQP2 trafficking. Recent findings by our group showed that treatment of renal principal cells with the V-ATPase inhibitor 4-acetyl-diphyllin (4AD) diminishes vesicular acidification and interferes with the AVP-induced AQP2 translocation into the plasma membrane. The results of this thesis show that 4AD inhibits V-ATPase in its assembled state and thus not only impairs its proton pumping activity, but also its reversible disassembly. The data suggest that this regulatory mechanism might play a role in AQP2-bearing vesicle fusion with the plasma membrane and metabolic regulation. The identification of proteins that control AQP2 trafficking is critical for the development of pharmacological agents that target AQP2 localisation for therapeutic purposes. Defective translocation of AQP2 causes water balance disorders, such as nephrogenic diabetes insipidus, which is characterized by incomplete urinary concentration. In contrast, a predominant localization of AQP2 in the plasma membrane is associated with excessive water retention in heart failure patients.Die cAMP-abhängige Serin/Threonin Proteinkinase A (PKA) ist ubiquitär exprimiert und der Haupteffektor des sekundären Signalmoleküls cAMP. Die Bindung von cAMP an die regulatorischen Untereinheiten von PKA bewirkt eine Konformationsänderung, durch die sich die katalytischen Untereinheiten vom Holoenzym lösen und Zielproteine phosphorylieren. A-Kinase Ankerproteine (AKAP) halten PKA in definierten Zellkompartimenten und ermöglichen so die räumliche und zeitliche Kontrolle der Phosphorylierung. Etwa 50 verschiedene, zum Teil zelltyp-spezifische AKAPs wurden bislang beschrieben. Klassische AKAPs binden PKA durch ein Motiv hydrophober Aminosäuren, das kürzlich von unserer Arbeitsgruppe um polare Ankerpunkte erweitert wurde. In dieser Doktorarbeit wird gezeigt, dass diese Ankerpunkte entscheidend für die Binding von regulatorischen Untereinheiten der PKA sind. Ein detailliertes Bild der AKAP-PKA Interaktion ist für die Entwicklung AKAP-spezifischer Pharmazeutika von großer Bedeutung. Ein Signalweg, der die Kontrolle der PKA-Aktivität durch AKAPs benötigt, ist die vom antidiuretischen Hormon Arginin-Vasopressin (AVP) regulierte Rückresorption von Wasser aus dem Primärharn im Sammelrohr der Niere. Die Binding von AVP an seinen von renalen Prinzipalzellen exprimierten Rezeptor bewirkt die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels, die Aktivierung von PKA und die dadurch induzierte Umverteilung von AQP2-haltigen Vesikeln in die Plasmamembran. Der Einbau von AQP2 in die Plasmamembran erhöht die Wasserdurchlässigkeit des distalen Bereichs des Nephrons und trägt so zur Feinregulation des Wasserhaushalts bei. Die der AQP2-Umverteilung zugrunde liegenden Signalwege sind noch nicht in vollem Umfang untersucht und vor allem Untersuchungen zur metabolischen Regulation des Vesikeltransports fehlen gänzlich. Die für diese Doktorarbeit durchgeführte Metabolomanalyse von primär isolierten Zellen aus dem renalen Sammelrohr der Ratte, IMCD Zellen, zeigt, dass die Stimulierung mit AVP keine substanziellen Änderungen der zellulären Stoffwechselwege induziert. Jedoch deutet die Identifizierung des metabolischen Enzyms Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH), sowie der Stoffwechselsensoren AMP-aktivierte Kinase (AMPK) und vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) auf AQP2-haltigen Vesikeln auf eine lokale Regulierung des Vesikeltransports durch Bestandteile des Metabolismus hin. Ergebnisse vorangegangener Studien unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass ein Inhibitor der V-ATPase, 4-acetyldiphyllin (4AD), die Ansäuerung von intrazellulären Vesikeln hemmt und die AVP-induzierte Umverteilung von AQP2 in die Plasmamembran beeinträchtigt. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass 4AD die reversible Dissoziation der V-ATPase-Untereinheiten hemmt. Dadurch wird nicht nur die Etablierung des Protonengradienten inhibiert, sondern auch regulatorische Mechanismen beeinflusst, die potenziell von einer Dissoziation der V-ATPase abhängen, wie Vesikelfusion und Stoffwechselsensorik. Die Erforschung von Proteinen und Signalwegen, die den AQP2-Transport kontrollieren, ist entscheidend für die Wirkstoffentwicklung zur Behandlung von Krankheiten, die mit einem gestörten Wasserhaushalt assoziiert sind, wie beispielsweise nephrogener Diabetes insipidus oder Herzinsuffizienz