Function, modification and application of O2-tolerant, NAD(P)+-reducing [NiFe]-Hydrogenases

Lösliche, NAD(P)+-abhängige [NiFe]-Hydrogenasen („Soluble Hydrogenase“, SH) katalysieren die reversible Spaltung von H2 in jeweils zwei Elektronen und Protonen sowie die damit gekoppelte Reduktion des Pyridinnukleotid-Kofaktors. Die beiden Reaktionen erfolgen in zwei unterschiedlichen Modulen, dem Hydrogenasemodul HoxHY, das das H2-spaltende aktive [NiFe]-Zentrum trägt, und dem flavinhaltigen NAD+-Reduktasemodul HoxFU. Die beiden aktiven Zentren sind über eine Reihe von [FeS]-Zentren elektronisch verbunden. Neben dem H2-Oxidierer Ralstonia eutropha H16 besitzen auch andere Knallgasbakterien wie Rhodococcus opacus und Hydrogenophilus thermoluteolus NAD+-abhängige Hydrogenasen, die aufgrund ihrer ungewöhnlichen Sauerstofftoleranz von besonderem Interesse sind. Für die SH aus Ralstonia eutropha (ReSH) wurde gezeigt, dass sie biotechnologisch für die H2-getriebene Regeneration von NADH eingesetzt werden kann. Allerdings ist die ReSH hochspezifisch für NAD+, während das phosphorylierte Derivat NADP+ nur in Spuren umgesetzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Substratspektrum der ReSH mithilfe gezielter Mutagenese auf NADP+ erweitert, was zu einer 240-fachen Erhöhung der katalytischen Effizienz für das neue Substrat führte. Die SH-Varianten mit synthetischer NADP+-Reduktionsaktivität wurden eingehend biochemisch und elektrochemisch charakterisiert und ihre Funktionalität in gekoppelten Enzymreaktionen gezeigt. Für die biotechnologische Anwendung der SH sind neben der Substratspezifität noch weitere Eigenschaften wie Thermostabilität und Salztoleranz von Bedeutung. Die heterologe Produktion der SH aus dem thermophilen Organismus Hydrogenophilus thermoluteolus (HtSH) in Ralstonia eutropha und die anschließende Reinigung ermöglichte erstmals eingehende biochemische und spektroskopische Untersuchungen dieser Hydrogenase mit besonderer Thermostabilität. Dabei zeigte sich im Vergleich zur ReSH ein höheres Temperaturoptimum von 80 °C und ein niedrigerer optimaler pH-Wert von 6.5. Infrarotspektroskopische Untersuchungen ergaben, dass auch die Streckschwingungen der für [NiFe]-Hydrogenasen typischen CN-- und CO-Liganden des aktiven Zentrums von denen der ReSH abweichen, was auf alternative Strukturen und/oder Redox-Zustände des aktiven Zentrums hindeutet. Im Falle der HtSH und der SH aus Rhodococcus opacus wurden Ähnlichkeiten hinsichtlich ihrer Reaktivität aufgedeckt. Im Gegensatz zur ReSH zeigten beide Enzyme nur in Anwesenheit von zweiwertigen Kationen wie Ni2+ und Mg2+ im Reaktionsansatz die typische H2-abhängige Reduktion von NAD+. Diese Kationen-Abhängigkeit wurde mit in dieser Arbeit konstruierten SH-Hybriden näher untersucht. Hierfür wurden die Hydrogenase- bzw. NAD+-Reduktase-Module von H. thermoluteolus und R. opacus heterolog in ∆hoxH- bzw. ∆hoxFU-Deletionsstämmen von R. eutropha produziert und durch die jeweiligen R. eutropha-eigenen Module zur vollständigen, chimären SH komplementiert. Durch diese Strategie konnte die Abhängigkeit für die zweiwertigen Ni2+- und Mg2+-Ionen eindeutig den Hydrogenasemodulen von H. thermoluteolus und R. opacus zugeordnet werden. Hybride, die das Hydrogenasemodule aus R. eutropha trugen zeigten H2-getriebene NAD+-Reduktaseaktivität auch ohne Zugabe dieser Kationen. Mit Ausnahme der SH-Variante aus HtHydrogenase und ReNAD+-Reduktase sind alle SH-Chimären in der Lage, autotrophes Wachstum von R. eutropha in einer Atmosphäre aus H2, O2 und CO2 zu vermitteln. Die Funktionalität dieser Hybridtechnik ermöglicht die Anpassung der biochemischen Eigenschaften entsprechend der gewünschten Reaktionsbedingung durch geeignete Modulkombination. Beispielsweise kann die im Vergleich zur ReSH höhere NAD+-Affinität der RoNAD+-Reduktase mit der aktiveren ReHydrogenase kombiniert werden, sodass ein SH-Hybrid entsteht, das im Gegensatz zur RoSH nicht abhängig von Kationen ist.Soluble, NAD(P)-dependent hydrogenases (SHs) catalyse the reversible splitting of H2 into two electrons and two protons followed by the reduction of the pyridine nucleotide cofactor. The two reactions take place in two different enzyme modules. The hydrogenase module consists of the subunits HoxHY and contains the active [NiFe]-center. The NAD+ reductase module comprised of HoxFU harbours a flavin close to the active site. A chain of [FeS] clusters electronically links both catalytic centers. Apart from the aerobic H2 oxidizer Ralstonia eutropha H16, there are further Knallgasbacteria such as Rhodococcus opacus and Hydrogenophilus thermoluteolus that possess SHs with extraordinary O2 tolerance, a very appealing feature for biotechnological applications. It has been shown that the SH from R. eutropha is well applicable for H2-driven cofactor recycling. While highly specific towards NAD+, its reactivity with NADP+ is very low. As a part of this work, the substrate spectrum of the ReSH was extended to NADP+ by rational mutagenesis resulting in a 240-fold higher catalytic efficiency for the new substrate. The SH variants with synthetic NADP+-reducing activity were characterized biochemically and electrochemically, and their functionality was challenged in coupled enzyme reactions. Apart from substrate specificity, improved thermostability and, e.g., salt tolerance is crucial for biotechnological application of SH. The thermophilic organism Hydrogenophilus thermoluteolus contains an SH (HtSH) with remarkable activity and stability at high temperatures. The HtSH was heterologously produced in R. eutropha, which enabled the first comprehensive enzymatic and spectroscopic study of this particular hydrogenase. In contrast to ReSH, the HtSH showed highest H2-dependent NAD+-reduction activity at 80°C and at pH 6.5. Infrared spectroscopic measurements revealed unusual vibrational stretching frequencies for the typical CO and CN- ligands of the H2-activating catalytic center, which differ from those known for ReSH. This indicates partially different structures/redox states of the active site. In case of the SHs from H. thermoluteolus and Rhodococcus opacus the H2-driven NAD+-reducing activity was found to depend strongly on the presence of divalent cations such as Ni2+ and Mg2+ in the enzyme assay. To obtain insight into this cation dependence, SH chimeras with mixed compositions of NAD+ reductase (HoxFU) and hydrogenase (HoxHY) modules of R. eutropha, R. opacus, and H. thermoluteolus were constructed. It turned out that the variants containing hydrogenase modules from either H. thermoluteolus or R. opacus in combination with the NAD+ reductase from R. eutropha showed cation-dependent, H2-driven NAD+ reduction activities. SH, chimeras carrying the hydrogenase module from R. eutropha were fully active also without additional Ni2+ and Mg2+. This identified the hydrogenase module to be responsible for the cation dependence. With exception of the SH-variant, which contains the hydrogenase module from H.thermoluteolus all chimeric SHs were able to facilitate autotrophic growth in R. eutropha under an atmosphere of H2, O2 and CO2. This subunit mixing system allows the optimization of biochemical features of the SH according to the desired reaction conditions. For example, the combination of highly NAD+-affine RoNAD+ reductase with the more active Rehydrogenase results in a chimeric SH that is not dependent on divalent cations in contrast to RoSH