Utvikling av analysemetode for fri fraksjon av midazolam for å studere effekt av hemodialyse på CYP3A-aktvitet i pasienter med nyresvikt

Introduksjon: Det er kjent at legemidler som elimineres via nyrene må doseres lavere ved nyresvikt. Nyere funn indikerer at aktivitet av transportproteiner og legemiddelmetaboliserende enzymer i tarm og lever også kan bli påvirket av kronisk nyresvikt. Den eksakte årsaken til dette eller hvor stor effekten er på ulike legemidler er ukjent. I HEMMER-studien skal den akutte effekten av hemodialyse på CYP3A-aktivitet i pasienter med nyresvikt studeres ved å bruke midazolam som probe. Fordi dialysepasienter ofte har avvikende konsentrasjoner av plasmaproteiner, er det avgjørende å kunne måle ubunden konsentrasjon av midazolam for nøyaktig bestemmelse av CYP3A aktiviteten. Hensikten med dette arbeidet er å utvikle en metode for å bestemme fri fraksjon av midazolam fra plasmaprøver. Metode: Centrifree Ultrafiltration Device (i denne oppgaven kalt «filtreringsenhet») ble benyttet for å filtrere ubundet midazolam i plasma til plasma ultrafiltrat (PUF). Ulik hastighet og tid på sentrifugeringen ble testet for å oppnå et tilstrekkelig volum av PUF og et tilfredsstillende utbytte av midazolam. For å forenkle prøveopparbeidelsen av kalibreringskurven ble det utført forsøk med Ringer-acetat som alternativ matriks. En ytterligere opprensning av PUF ble forsøkt ved væske-væske ekstraksjon (LLE) og proteinfelling. Det ble også beregnet uspesifikk binding av midazolam til filtreringsenheten under prøveopparbeidelsen samt utbytte av midazolam. Den utviklede prøveopparbeidelsesmetoden ble benyttet for å beregne fri fraksjon av midazolam i én pasient med kronisk nyresvikt som ble behandlet med hemodialyse som er inkludert i HEMMER-studien. Resultater: Sentrifugering med en fiksert vinkel rotor i 45 minutter med en hastighet på 1500 x g ga høyest volumutbytte av PUF, men sentrifugering ved 1500 x g i 30 minutter ga høyest utbytte av midazolam. Kalibreringskurver laget med Ringer-Acetat ga sammenlignbare resultater med prøver laget i PUF. En påfølgende prøveopparbeidelse med proteinfelling ga best utbytte av midazolam med 87% med lav variasjon. Det var lav uspesifikk binding av midazolam til filtreringsenheten (< 15%). Det ble beregnet en fri fraksjon av midazolam dagen etter dialyse og dagen før dialyse for én pasient på henholdsvis 0,4% og 0,6%. Konklusjon: Det har blitt utviklet en metode for å kvantifisere fri fraksjon av midazolam. Metoden viste lav uspesifikk binding av midazolam til filtreringsenheten og et tilfredsstillende utbytte av midazolam med lav variasjon, som tyder på at prøveopparbeidelse ved ultrafiltrering er en egnet metode for å kvantifisere fri fraksjon av midazolam. Farmakokinetiske data fra én pasient i HEMMER-studien indikerer at det kan være en forskjell i fri fraksjon av midazolam dagen etter og dagen før dialyse