Avaliação da tolerância a ácidos carboxílicos inibidores de fermentação por leveduras assimiladoras de pentoses

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017.A produção de etanol de segunda geração é dependente da eficiente fermentação dos açúcares presentes nos hidrolisados lignocelulósicos, principalmente glicose e xilose. Essa eficiência muitas vezes é afetada pela presença de compostos tóxicos capazes de inibir os microrganismos responsáveis pela fermentação. Dentre os principais inibidores encontrados em hidrolisados destacam-se o ácido acético e o ácido fórmico. A presença de concentrações elevadas desses inibidores pode causar danos as células, reduzindo a produção de etanol. Para suprimir esses efeitos negativos, alguns autores destacam a necessidade da descoberta de microrganismos capazes de tolerar a presença desses compostos tóxicos. Outra estratégia factível seria a modificação genética de leveduras já empregadas em processos industriais, visando aumentar sua tolerância. O presente trabalho avaliou a fermentação de diferentes carboidratos e a tolerância de cepas de leveduras selvagens à diversas concentrações de ácido acético e fórmico em meios contendo glicose e xilose. Com isso, uma dessas cepas foi selecionada para fermentações em batelada simples de hidrolisados de hemicelulose. Neste trabalho, foi feita a modificação genética de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae através da sobre-expressão do gene TAL1, que codifica a enzima transaldolase da via das pentoses fosfato. Esta modificação visa alterar o metabolismo de xilose, aumentando a tolerância aos inibidores de fermentação. Nossos resultados demonstraram que as 12 cepas de leveduras selvagens utilizadas neste trabalho foram capazes de metabolizar a xilose com diferentes rendimentos de etanol, destacando-se as cepas HMD-14.2 e HMD-2.1, da espécie Spathaspora passalidarum. No entanto, quando na presença dos inibidores de fermentação, observamos que esse excelente desempenho fermentativo sofreu uma redução expressiva. Quando conduzidos nos hidrolisados, com concentrações de até 20 g·L-1 de xilose e 44 mM de ácido acético, a cepa HMD-2.1 demonstrou excelente desempenho fermentativo, entretanto quando a concentração de açúcar no meio foram aumentadas para cerca de 50 g·L-1 esta não obteve desempenho comparável com as linhagens de S. cerevisiae. Em paralelo, com a construção da cepa com o gene TAL1 sobre-expresso (JDY-01), os ensaios de fermentação em batelada demonstraram que o consumo total de xilose e a produtividade de etanol da cepa JDY-01 foi consideravelmente maior que as apresentadas pela cepa parental ao fim da fermentação. Em conclusão, a sobre-expressão do gene TAL1 foi capaz de acelerar o fluxo metabólico, gerando melhorias no consumo da xilose e, consequentemente, na produtividade de etanol. Esses dados sugerem que a sobre-expressão do gene TAL1 possivelmente esteja suprimindo o efeito deletério causado pela presença de acetato e formiato no hidrolisado de hemicelulose.Abstract : Second-generation ethanol production depends on the efficient fermentation of sugars presents in lignocellulosic hydrolysates, above all glucose and xylose. This efficiency is affected by the presence of toxic compounds capable of inhibiting the microorganisms responsible for fermentation. Among the main inhibitors found in hydrolysates we have acetic acid and formic acid. The presence of these inhibitors at high concentrations in the media can cause cell damage, subsequently reflected in the reduction of ethanol production. To overcome these negative effects, some researches is looking for new microorganisms capable of tolerating the presence of these toxic compounds. Another feasible strategy would be the genetic modification of yeasts already used in industrial processes, aiming to increase their tolerance. The present work evaluated the fermentation of different carbohydrates and tolerance of wild yeast strains to various concentrations of acetic and formic acid in media containing glucose and xylose. Thus, one of these strains was selected for simple batch fermentations of hemicellulose hydrolysates. Moreover, adds to this study the genetic modification of a Saccharomyces cerevisiae strain by the overexpression of the TAL1 gene, responsible for encoding a pentose phosphate pathway enzyme. This modification aims to modify the metabolism of xylose, increasing tolerance to fermentation inhibitors. Our results show that the 12 wild yeast strains used in this work were able to metabolize xylose with different ethanol yields, especially the HMD-14.2 and HMD-2.1 Spathaspora passalidarum species. However, when conducted in the presence of fermentation inhibitors, we observed that this excellent performance suffered a significant reduction. When conducted in hemicellulose hydrolysates with concentrations of up to 20 g·L-1 xylose and 44 mM l-1 acetic acid, the HMD-2.1 strain demonstrated excellent fermentation performance, however in the medium with increased sugar levels, the same strain did not show efficient performance like the S. cerevisiae strains. At the same time, with the construction of strain JDY-01 (TAL1 gene overexpressed), the batch fermentations show that the total consumption of xylose and the ethanol productivity of the JDY-01 strain is considerably higher than those presented by the parental strain at the end of fermentation. In conclusion, the overexpression of the TAL1 gene was able to accelerate the metabolic flux, generating improvements in xylose consumption and consequently in the ethanol productivity. These data suggest that over-expression of the TAL1 gene is possibly suppressing the deleterious effect caused by the presence of acetate and formate in the hemicellulose hydrolyzate