Interação entre o milho (Zea mays), a bactéria benéfica endofítica Herbaspirillum seropedicae e o fungo patogênico Colletotrichum graminicola

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2017.Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica endofítica promotora de crescimento vegetal (BPCV) capaz de exercer inúmeros benefícios às gramíneas com as quais se associa, incluindo o milho. Por outro lado, Colletotrichum graminicola, é um fungo patogênico que causa antracnose no milho, doença que pode acometer todos os órgãos dessa planta e causar severos danos às lavouras. O objetivo geral do trabalho consistiu em estudar a interação entre o milho e H. seropedicae SmR1 em duas condições de cultivo, em relação a detecção e quantificação de transcritos da bactéria na planta; e entre o milho, H. seropedicae e C. graminicola na presença ou ausência de substâncias húmicas, em relação à expressão dos sintomas da antracnose na planta. Num primeiro momento, realizou-se a inoculação de plantas de milho (P30F53) crescidas in vitro e em solo com H. seropedicae SmR1. As plantas in vitro foram coletadas aos 4, 7 e 10 dias após a inoculação (DAI), e as cultivadas em solo aos 14, 21 e 28 DAI. Raízes e folhas foram submetidas a ensaios de qPCR a fim de se detectar a presença do DNA de H. seropedicae utilizando-se os sistemas de detecção SYBR Green (previamente estabelecido), e sonda TaqMan. Os resultados apontam para o estabelecimento de uma metodologia mais específica para o monitoramento da colonização de H. seropedicae em tecidos vegetais cultivados em condições estéreis ou não estéreis com a utilização da sonda TaqMan em comparação com SYBR Green. Ensaios de RT-qPCR também foram realizados a fim de se medir os transcritos dos genes nifH, rpoC e hrcN de H. seropedicae em raízes de milho por quantificação absoluta. Assim, foi possível monitorar os genes nifH e rpoC em condições experimentais estéreis e não-estéreis. O segundo trabalho envolveu a investigação do potencial de H. seropedicae como agente de controle biológico para conter a antracnose foliar causada pelo fungo patogênico C. graminicola em milho. Foram realizados dois ensaios. O primeiro consistiu no tratamento de plântulas de milho (P30F53) com H. seropedicae SmR1 e inoculação de C. graminicola aos 7, 14 e 21 dias após o tratamento (DAT). O segundo, foi realizado com tratamento de H. seropedicae associado a substâncias húmicas e inoculação do fungo patogênico aos 3 e 7 DAT. Foi realizado ensaio de quantificação de DNA por qPCR para comprovar a colonização das plantas por H. seropedicae. A análise da severidade da doença foi realizada através da medição da área foliar necrótica e clorótica, com o auxilio do software Quant®. Foi demostrado que H. seropedicae colonizou efetivamente as folhas de milho, porém não foi constatado efeito do tratamento com H. seropedicae sobre a severidade da doença em ambos os ensaios. Sendo assim, pode se concluir que a partir do presente trabalho foi possível detectar a presença e medir a quantidade de transcritos da bactéria H. seropedicae em plantas de milho. Além disso, não foi verificado efeito da bactéria H. seropedicae associada ou não a substâncias húmicas, no controle da antracnose nas plantas de milho.Abstract : Herbaspirillum seropedicae is an endophytic diazotrophic plant growth promoting bacteria (BPCV). It is able to exert numerous benefits to the associated host plant, including maize. On the other hand, Colletotrichum graminicola is a pathogenic fungus that causes anthracnose in maize, which attack every organs of this plant and cause severe damages to the crops. This study?s main goal was to study the association between maize cultivated in two different growth conditions and H. seropedicae SmR1 related to bacterial detection and quantification of transcripts in planta; and between maize, H. seropedicae and C. graminicola with or without humic substances, related to anthracnose symptoms in plants. The first part of this study consisted on H. seropedicae SmR1 inoculation of maize plants (P30F53) grown in vitro and in soil. In vitro plants were collected at 4, 7 and 10 days after inoculation (DAI), and soil plants were harvested at 14, 21 and 28 DAI. Plants roots and leaves were submitted to qPCR assays to detect the presence of H. seropedicae DNA using as detection systems both SYBR Green (previously established) and TaqMan probe reagents. Results allow the establishment of a more specific methodology for monitoring the colonization of H. seropedicae in plant tissues cultivated in sterile or nonsterile conditions with TaqMan probe in comparison with SYBR Green. Assays using RT-qPCR were also performed to measure the expression of H. seropedicae nifH, rpoC and hrcN genes in roots of maize by absolute quantification. As a result, it was possible to monitor the expression of nifH and rpoC H. seropedicae genes in maize grown under sterile and non-sterile experimental conditions. The second part of this work consisted in investigation of H. seropedicae potential use as biological agent in controlling foliar anthracnose caused by C. graminicola in maize. In this sense, two tests were performed. The first one consisted of maize plantlets (P30F53) treatment with H. seropedicae SmR1, followed by inoculation of C. graminicola at 7, 14 and 21 days after treatment (DAT). The second one was carried out by H. seropedicae associated to humic substances treatment, followed by pathogen inoculation at 3 and 7 DAT. H. seropedicae DNA quantification was performed by qPCR to confirm the plant colonization by the bacteria. Assessments of disease severity were performed by necrotic and chlorotic leaf area measurements, using software Quant®. As results, it was shown effective leaf colonization by H. seropedicae. Despite that, no effects in disease severity was observed by H. seropedicae treatment in both assays. In conclusion, in this study it was possible to detect and quantify H. seropedicae transcripts contents in maize plants. In addition, it was not observed any effect of H. seropedicae, associated or not to humic substances, in anthracnose disease control in maize plants