Caracterização e quantificação de Escherichia coli de moluscos bivalves por PCR tem tempo real

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2017.O estado de Santa Catarina é o maior produtor nacional de ostras e mexilhões cultivados, atividade econômica importante e que confere destaque ao estado. Os moluscos bivalves, através da filtração da água, tendem a acumular em seus tecidos, vírus e bactérias que estejam presentes na água de cultivo. Dentre as bactérias, a incidência de Escherichia coli em moluscos bivalves foi reportada em diversos estudos e cepas patogênicas foram relacionadas a casos de gastroenterites. O controle microbiológico adotado em diferentes países é a contagem de E. coli na água e/ou nos moluscos bivalves. Métodos convencionais para contagem de E. coli em alimentos são demorados e trabalhosos, tornando- se, desta forma, necessário o desenvolvimento de metodologias mais rápidas, que forneçam resultados sensíveis e robustos. No presente trabalho, uma metodologia para quantificação de E. coli em ostras utilizando qPCR foi desenvolvida. Sondas e iniciadores foram desenhados e amplificaram seletivamente DNA de E. coli. Os iniciadores e sondas demonstraram-se sensíveis e seletivos para a detecção de E. coli mesmo na presença de DNA proveniente da amostra. A eficiência, seletividade e o coeficiente de correlação das curvas padrão estão de acordo com as recomendações da literatura. O método desenvolvido foi comparado com um método dependente de cultivo na quantificação de E. coli em ostras naturalmente e artificialmente contaminadas e uma boa correlação foi encontrada entre os dois métodos. Além de estudos sobre a incidência de E. coli nos moluscos, informações acerca das características fenotípicas e genotípicas das cepas são consideradas de grande relevância. Cepas de E. coli isoladas de amostras de moluscos bivalves coletados em Santa Catarina, Brasil e na Baía de Cheesapeake, nos Estados Unidos, foram caracterizadas. Determinou-se o perfil de resistência a antimicrobianos, sorologia e tipagem molecular. Os resultados mostraram que dentre as 141 cepas estudadas, 19,9 % foram classificadas como multirresistentes e os antimicrobianos cefalotina (78 %), nitrofurantoina (21,3 %) e ampicilina (19,2 %) foram aqueles com maior porcentagem de resistência. Os sorogrupos predominantes foram: O8 (17 %), O6 (7 %), O21 (4 %) e seis sorogrupos (O6, O9, O25, O54, O88 e O113) foram encontrados em cepas provenientes de ambos os países. Os resultados da eletroforese em campo pulsado revelaram uma grande variação genética entre as cepas, entretanto, considerando 80 % de similaridade, seis clusters continham cepas do Brasil e dos Estados Unidas juntos, mostrando uma relação genética entre as cepas.Abstract : The state of Santa Catarina is the major national producer of oysters and mussels, this in an important economic activity that gives a special position for the state. Bivalve mollusks, through their filter-feedind, tend to accumulate in their tissues, viruses and bacteria that are present in the surround water. Among the bacteria, the incidence of E. coli in bivalve mollusks was reported in several studies and pathogenic strains were related to cases of gastroenteritis. The microbiological control in different countries is the E. coli counts in water and/or bivalve mollusks. Conventional methods for E. coli counts in food are time-consuming and labour, which emphasizes the necessary of develop faster methodologies that provide sensitive and robust results. In the present work, a methodology for quantification of E. coli in oysters using qPCR was developed. Probe and primers were grown and selectively amplified E. coli DNA. The designed primers and probe set enable selective and sensitive detection of E. coli even in the presence of DNA from oyster samples. The efficiency, good correlation and selectivity results found are in agreement with the recommendations by the literature. The developed method was compared with a culture-dependent method for quantification of E. coli in naturally and artificially contaminated oysters. A good correlation was found between the two methods. In addition of studies on the incidence of E. coli in mollusks, information about the phenotypic and genotypic characteristics of the strains is considered of great relevance. E. coli strains isolated from samples of bivalve mollusks collected in Santa Catarina, Brazil and in Cheesapeake Bay, United States, were characterized. The antimicrobial resistance profile, serology and molecular typing was determined. The results showed that among the 141 isolates, 19.9 % were classified as multi-drug resistant (MDR) and resistance was most frequently observed in cephalothin (78 %), nitrofurantoin (21.3 %) and ampicillin (19.2 %). The predominant serogroups were: O8 (17 %), O6 (7 %), O21 (4 %) and six serogroups (O6, O9, O25, O54, O88 and O113) were shared by isolates from Brazil and USA. The results of pulsed field electrophoresis revealed a great genetic variation among the strains. However, considering 80% of similarity, six clusters contained Brazil and the United isolates, reflecting a genetic relatedness among them