Estudo dos mecanismos envolvidos no efeito tipo-antidepressivo e neuroprotetor do ácido ursólico

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2017.Uma série de estudos têm sugerido que o ácido ursólico (AU) possui um potencial como antidepressivo, sendo que este composto triterpenóide (isolado de plantas como Rosmarinus officinalis L.) reduz a imobilidade de camundongos submetidos ao teste de suspensão pela cauda (TSC). Este efeito tipo-antidepressivo depende, em parte da atividade monoaminérgica. Além disso, já foi indicado que o AU apresenta efeitos neuroprotetores e anti-estresse em modelos in vivo e in vitro. O presente trabalho verificou: a) participação de proteínas cinase e, b) o envolvimento da ativação da enzima antioxidante heme oxigenasse 1 (HO-1) no efeito tipo-antidepressivo do AU no TSC em camundongos. Adicionalmente, utilizamos um modelo in vitro que mimetiza os efeitos neurotóxicos da produção exacerbada de glicocorticóides que ocorre frente a eventos crônicos de estresse e que, em consequência, induzem a morte neuronal hipocampal e podem estar relacionados com o desenvolvimento do transtorno depressivo maior. Com este modelo in vitro investigamos: c) a capacidade do AU em proteger as células HT22 dos efeitos citotóxicos da corticosterona assim como a participação de proteínas cinase e de HO-1 neste efeito. O efeito tipo-antidepressivo do AU no TSC foi abolido pelos inibidores: H-89 (inibidor de proteína cinase A, PKA), KN-62 (inibidor de proteína cinase II dependente de Ca+2/calmodulina, CaMKII), queleritrina (inibidor da proteína cinase C, PKC), U0126 (inibidor da cinase regulada por sinal extracelular 1/2, inibidor de MEK1/2) PD09058 (inibidor de MEK1/2,) e a protoporfirina de zinco (inibidor de HO-1) mas não pela wortmanina ou LY294002 (inibidores de fosfatidilinositol-3-cinase ou PI3K). A combinação de doses sub-efetivas de AU com a protoporfirina de cobalto (ativador de HO-1) induziu um efeito tipo-antidepressivo no TSC em camundongos. O tratamento dos animais com AU (assim como com PPCo) induziu um aumento dos níveis de HO-1 no hipocampo dos camundongos. Os ensaios in vitro demonstraram que a incubação durante 48 h, mas não 24 h com 5 ou 15 µM de AU e a co-incubação durante 24 h com 50 µM de corticosterona protegeu as células HT22 da redução da viabilidade, da morte celular, do apoptose e do aumento da formação de vesículas ácidas sugestivas de autofagia induzidos pela corticosterona. Além disso, a incubação das células HT22 com AU foi capaz de reverter a redução dos níveis de fosforilação de ERK1/2, mas não de JNK induzidos pela corticosterona. O efeito citoprotetor do AU frente a citotoxicidade induzida pela corticosterona foi abolido por H-89, KN-62 e queleritrina, mas não pelo LY294002. Nenhuma das condições experimentais in vitro alteraram o imunoconteúdo de HO-1. Como conclusão, os dados presentes neste trabalho sugerem que o efeito anti-imobilidade no TSC em camundongos e protetor do AU frente à citotoxicidade induzida pela corticosterona em células HT22 depende, pelo menos em parte, da ativação de PKA, PKC, MEK/ERK1/2 e CaMKII, mas não de PI3K. Além disso, de forma diferente ao efeito citoprotetor in vitro, o efeito tipo-antidepressivo do AU no TSC em camundongos depende também em parte da ativação de HO-1. Este conjunto de dados indica que o AU possui um potencial como antidepressivo e neuroprotetor principalmente graças a sua capacidade de modular vias de sinalização envolvidas na sobrevivência, proliferação e mecanismos antioxidantes.Abstract : Several studies have suggested that ursolic acid (UA) may have a potential as antidepressant, since this triterpenoid compound (isolated from plants such as Rosmarinus officinalis L.) induced the reduction of the immobility time of mice submitted to the tail suspension test (TSC). This antidepressant-like effect may depend, at least in part, on monoaminergic system. In addition, several studies reported that UA presented neuroprotective and anti-stress effects in in vivo and in vitro models. The present study evaluated: a) the involvement of protein kinases and, b) the participation of heme oxygenase 1 (HO-1) in the antidepressive-like effect of UA in the TSC in mice. Additionally, we performed an in vitro model that mimics the neurotoxic effect of an exacerbated production of glucocorticoids that occurs as a result of chronic stressful events, which in consequence may induce hippocampal neuronal loss that may be related to the development of major depressive disorder. Using this experimental model, we investigated c) the neuroprotective effect of UA against the cytotoxicity induced by corticosterone in HT22 cells as well as the participation of protein kinases and HO-1 in this effect. The antidepressant-like effect of UA was abrogated in the TSC by H-89 (inhibitor of protein kinase A or PKA), KN-62 (inhibitor of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II or CaMKII), chelerythrine (inhibitor of protein kinase C or PKC), U0126 or PD09058 (inhibitors of mitogen-activated protein kinase 1/2 or MEK1/2) and zinc protoporphyrin IX (inhibitor of HO-1) but not by wortmannin or LY294002 (inhibitors of phosphoinositide 3-kinase, PI3K). The combination of sub-effective doses of cobalt protoporphyrin IX (inductor of HO-1) and UA induced an antidepressive-like effect in the TSC in mice. The treatment of animais with UA or PPCo induced an increased level of HO-1 in the hippocampus of mice. On the other hand, the in vitro experiments showed that the incubation for 48 but not 24 h with 5 or 15 µM UA before the co-incubation with 50 µM corticosterone protected the HT22 cells from the cytotoxicity, apoptosis and formation of acidic vesicular organelles indicative for autophagy induced by corticosterona. In these experiments, the treatment of HT22 cells with UA also prevented the reduction of phosphorylated ERK1/2 but not JNK levels induced by corticosterone treatment. This cytoprotective effect of UA against corticosterone cytotoxicity was abolished by H-89, KN-62 and quelerythrine, but not by LY294002. None of the in vitro experimental conditions induced an alteration in the immunocontent of HO-1. As a conclusion, the data presented here indicated that the antiimmobility effect in the TSC in mice and the protective effect of UA against the cytotoxicity induced by corticosterone in HT22 cells may involve the activation of PKA, PKC, MEK/ERK1/2 and CaMKII but not PI3K activity. In contrast to the in vitro neuroprotective effect of UA, the antidepressive-like effect in the TSC in mice may depend, at least in part, on HO-1 activity. Finally, we can conclude that UA is a compound with neuroprotective and antidepressant potential for stress-related disorders mainly by its capacity to modulate intracellular signaling pathways involved in proliferation, survival and antioxidant mechanisms