Metabolismo das pterinas e da dopamina em mecanismos de nocicepção e fadiga

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Desportos, Programa de Pós-Graduação em Educação Física, Florianópolis, 2017.As pterinas são uma classe de compostos heterocíclicos naturais. Dentre elas, está a 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4), cofator enzimático obrigatório para síntese de dopamina (DA), serotonina (5-HT) e óxido nítrico. As concentrações intracelulares da BH4 são mantidas por três vias metabólicas, sendo estas a síntese de novo, a via de reciclagem e a via de salvação. Este trabalho investigou a participação do metabolismo da BH4 e da DA na indução de fadiga e nos mecanismos de nocicepção sob condições inflamatórias. Inicialmente, investigou-se o efeito da desregulação dopaminérgica no desenvolvimento de fadiga e o efeito protetor da atividade física em camundongos Suíços adultos machos submetidos a um modelo experimental de doença de Parkinson (DP) pela administração repetida de reserpina (2 x 1mg/kg; i.p). Os sintomas de fadiga foram caracterizados pela redução na distância percorrida na roda de correr e no desempenho em um teste de esforço físico, sem demonstrar participação de fatores emocionais, nociceptivos ou metabólicos periféricos. A restituição das concentrações cerebrais de DA, induzida com a administração de L-DOPA/benserazida (100/50 mg/kg; i.p), atenuou os sintomas de catalepsia e fadiga. Ainda, foi verificado que a reserpina (10?M) per se não comprometeu a viabilidade celular, liberação de lactato ou consumo de oxigênio mitocondrial em miotubos L6, indicando que os sintomas de fadiga parecem ser devidos exclusivamente ao prejuízo na neurotransmissão dopaminérgica, o que levaria a corroborar a fadiga como um sintoma não motor de origem central na DP. Posteriormente, investigou-se o efeito do tratamento com o inibidor da SR, SPRi3 (300 mg/kg; i.p.), sobre a nocicepção e liberação de biomarcadores em urina de camundongos Balb/c adultos machos submetidos a um modelo experimental de artrite reumatoide induzida pelo coquetel de anticorpo de colágeno anti-tipo II (CAIA; 1,5 mg/animal; i.p) e seguido da administração de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS; 50 ?g/animal; i.p). O protocolo CAIA que corresponde a um modelo de dor crônica, caracterizou-se por duas fases, uma aguda inflamatória (entre os dias 4-25) e outra crônica de hipersensibilidade à dor (entre os dias 25-50). Observou-se que o inibidor SPRi3 reduziu a hipersensibilidade a dor térmica, a qual foi acompanhada de uma redução nas concentrações de BH4 e aumento de sepiapterina urinária em ambas as fases do modelo. Verificamos também que a sepiapterina só acumula quando o inibidor12está presente, mostrando a potencialidade desta pterina como biomarcador sensível de analgesia. Em adição, a inibição dos macrófagos por clodronate (0,84 mg/kg; i.p) no protocolo CAIA também reduziu a produção de BH4 e a hipersensibilidade a dor térmica, demonstrando a influência da ativação do sistema imune sobre a produção excessiva de BH4 e consequente potenciação do efeito álgico. Finalmente, investigou-se a produção de neopterina urinária e a concentração dos neurotransmissores DA e 5-HT e seus metabólitos no estriado de camundongos C57BL/6 adultos machos submetidos a inflamação persistente por duas semanas através da infusão contínua de LPS (0,33 ou 0,83 mg/kg; bombas osmóticas) e a um protocolo de exercício físico moderado (três semanas em esteira; 5 sessões/semana de até 50 min/dia). Observou-se que o sistema dopaminérgico foi comprometido pelo estado inflamatório (LPS 0,33 mg/kg) e que o exercício físico preveniu o aumento na produção de neopterina urinária e a redução da atividade do complexo I mitocondrial, induzido pela administração contínua de LPS (0,83 mg/kg), indicando assim, que o exercício físico de intensidade moderada, pode ser uma ferramenta valiosa para a prevenção dos efeitos causados por um estado inflamatório sustenido. Em conclusão, a farmacoterapia com L-DOPA e atividade física indicam ser tratamentos apropriados para combater os sintomas de fadiga presentes com uma alta prevalência em pacientes com DP, e as pterinas, neopterina e sepiapterina, sensíveis biomarcadores para monitorar a ativação do sistema imune e a eficácia de um tratamento analgésico, respectivamente.Abstract : Pterines are a class of natural heterocyclic compounds. The pterin 5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4) is an obligatory enzymatic cofactor for the synthesis of dopamine (DA), serotonin (5-HT) and nitric oxide. The intracellular concentrations of BH4 are maintained by three metabolic pathways, which are the de novo synthesis, the recycling and the salvage pathways. This study investigated the participation of BH4 metabolism and DA in the induction of fatigue and in the molecular mechanisms of nociception under inflammatory conditions. Initially, the effect of dopaminergic dysregulation on the development of fatigue and the protective effect of physical activity was investigated in adult male Swiss mice submitted to an experimental model of Parkinson disease (PD) by the repeated administration of reserpine (2 x 1mg/kg; i.p). The reserpine-induced model was characterized by the reduction in running wheel distance and performance in a physical effort test, pointing to the induction of fatigue. Additionally, this effect was independent of emotional, nociceptive or metabolic factors. Restoration of brain DA levels induced with L-DOPA/benserazide (100/50 mg/kg; i.p), attenuated the symptoms of catalepsy and fatigue. Furthermore, reserpine (10?M) per se did not compromise cell viability, lactate release or mitochondrial oxygen consumption in L6 myotubes. These data indicate that fatigue symptoms appear to be due exclusively to an impairment in the dopaminergic neurotransmission, corroborating fatigue as a central non-motor symptom in PD. Afterwards, the SR inhibitor effect (SPRi3; 300 mg/kg, ip) was investigated on nociception parameters and on the release of biomarkers in urine from male Balb/c mice submitted to an experimental model of rheumatoid arthritis induced by the anti-type II collagen antibody cocktail (CAIA, 1.5 mg/animal, ip) and followed by administration of bacterial lipopolysaccharide (LPS; 50 µg/animal; ip). The CAIA protocol, which corresponds to a chronic pain model, was characterized by two phases, an acute inflammatory phase (between days 4-25) and the chronic pain hypersensitivity phase (between days 25-50). It was observed that the SPRi3 inhibitor reduced the hypersensitivity to thermal pain, which was accompanied by a reduction in BH4 levels and increase of urinary sepiapterin in the both phases of the CAIA protocol. It was also verified that sepiapterin only accumulates when the inhibitor is present, showing the potentiality of this pterin as a sensitive biomarker of analgesia. In addition, macrophage inhibition by clodronate (0.84 mg/kg; ip) in the protocol also reduced BH4 production and heat pain hypersensitivity,14demonstrating the influence of immune system activation on the excessive production of BH4 and consequent potentiation of algesia. Finally, we investigated the production of urinary neopterin and the levels of the neurotransmitters DA and 5-HT and their metabolites in the striatum of adult male C57BL/6 mice submitted to persistent inflammation for two weeks by continuous infusion of LPS (0.33 or 0.83 mg/kg, Alzet osmotic pumps) and to a moderate physical exercise protocol (treadmill for three weeks; 5 sessions/week; up to 50 min/day). It was observed that the dopaminergic system was compromised by the inflammatory state (LPS 0.33 mg/kg) and that exercise prevented the increase in the production of urinary neopterin and the reduction of mitochondrial complex I activity, induced by continuous administration of LPS (0.83 mg/kg), indicating that moderate intensity exercise can be a valuable tool for the prevention of the effects caused by a sustained inflammatory state. In conclusion, L-DOPA pharmacotherapy and physical activity indicated to be appropriated treatments to combat fatigue symptoms, highly prevalent in patients with PD, and the pterines, neopterin and sepiapterin sensitive biomarkers to monitor the activation of the immune system and the effectiveness of an analgesic treatment, respectively