Avaliação, em modelos de primatas e murinos, de candidatos vacinais baseados em antígenos eritrocitários de Plasmodium vivax

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017.Antígenos presentes na membrana dos merozoítos dos Plasmodium spp. são excelentes candidatos vacinais contra a malária, visto que muitas dessas proteínas são essenciais para a invasão dos eritrócitos hospedeiros. O desenvolvimento de uma vacina contra os estágios sanguíneos do parasito da malária, visa bloquear a ligação parasito-eritrócitos, a fim de diminuir ou eliminar os sintomas da doença. Esses sintomas, são resultantes da liberação das toxinas e dos compostos imunoestimuladores após lises repetitivas dos eritrócitos infectados. Neste estudo, foi avaliada a imunogenicidade e os níveis de proteção, após um desafio com os parasitos vivos do Plasmodium vivax, em macacos Aotus lemurinus griseimembra. O estímulo foi efetuado utilizando uma formulação vacinal experimental contendo quatro antígenos do estágio sanguíneo (Antígeno do merozoíto apical 1 -AMA1, Proteínas da superfície do merozoíto 1 -MSP-1, Proteína de ligação ao antígeno Duffy-DBP, Merozoite Apical Erythrocyte Binding-ligand -MAEBL) desse protozoário. Além disso, também avaliamos um novo candidato vacinal, denominado MAEBL, pertencente à mesma família de proteínas de ligação aos eritrócitos (EBLs) na tentativa de otimizar a formulação original da vacina. Os resultados dos ensaios utilizando os macacos mostraram que a formulação vacinal contendo o AMA-1, MSP119 e as duas variantes da DBP-II formulada em adjuvante Montanide ISA720 é altamente imunogênica. Tal combinação de antígenos foi inoculada por via subcutânea sob a forma de proteínas (duas doses) e adenovírus (reforço final) recombinantes, obtendo-se o aumento sequencial dos anticorpos totais (até 1: 32000). Como resultado foi observado que os títulos de anticorpos foram intensamente impulsionados após o desafio com parasitos vivos. Os títulos de anticorpos por imunofluorescência também foram elevados (até 1:12000) e altamente específicos contra os merozoitos do P. vivax fixados em lâminas microscópicas. Quando examinamos as citocinas secretadas após as imunizações, foi observado o aumento das concentrações de IFN? e IL-2 nos macacos imunizados. No entanto, nenhuma diferença significativa foi detectada durante as análises matemáticas. A parasitemia demostrou que os macacos melhor imunizados apresentaram melhor proteção, com diminuição dos níveis máximos de parasitemia. Além disso, os macacos mostraram um encurtamento no periodo de infecção, o qual nunca ultrapassou os 18 dias nos animais imunizados, sendo patente até o dia 28 nos animais controle. Não foi possível obter proteção estéril com a formulação vacinal em teste. Na tentativa de melhorar ainda mais a formulação vacinal, foi também estudado um novo antígeno denominado MAEBL, presente tanto no estágio hepático como no sanguíneo. Primeiro, foi efetuada uma análise in silico do gene putativo da proteína MAEBL em comparação com a sequência da MAEBL do P. yoelii, previamente publicada. O gene códon-otimizado para expressão em células eucarióticas, foi sintetizado e incorporado no genoma do vector adenoviral de tipo 5 humano deficiente de replicação. Testes iniciais de transcrição e tradução do RNA foram realizados indicando a correta produção do RNA mensageiro que codifica o transgene, bem como da proteína PvMAEBL recombinante. Camundongos C57BL/6 imunizados com este adenovírus foram parcialmente protegidos contra o desafio cruzado com os parasitos vivos de roedores P. yoelii, indicando não apenas que a vacina candidata é imunogênica, mas também que induz a proteção cruzada entre as duas espécies de Plasmodium. Este estudo demonstrou que um candidato vacinal com capacidade para proteger parcialmente contra a malária de P. vivax foi gerado. Novos esforços estão sendo feitos para melhorar mais ainda esta formulação mediante a adição/troca de novas proteínas, incluindo MAEBL e/ou outros antígenos para realizar futuros testes de vacina contra P. vivax.Abstract : Antigens present on the membrane of Plasmodium spp. merozoites are excellent vaccine candidates against malaria because many of those proteins are required for invasion of host erythrocytes. Developing a vaccine against the blood stages of the malaria parasite aims at blocking this parasite-erythrocyte bond in order to decrease or eliminate the symptoms of the disease, which result from the release of toxins and immune-stimulating compounds after the repetitive burst of infected erythrocytes. In this study we have evaluated, in twelve Aotus lemurinus griseimembra monkeys, the immunogenicity and the levels of protection elicited against a challenge with live Plasmodium vivax parasites induced by an experimental vaccine formulation containing four blood-stage antigens of this protozoan parasite. Additionally, we have also evaluated a new vaccine candidate, denominated MAEBL, belonging to the same family of erythrocyte-binding ligands (EBLs) in an attempt to optimize the original formulation of the vaccine. Results of monkey experiments show that the vaccine formulation containing apical membrane antigen 1 (AMA-1), merozoite surface protein 1- 19KDa fragment- (MSP119) and two variants of the Duffy-binding protein region II (DBP-II, PA and MT) formulated in Montanide ISA720 adjuvant is highly immunogenic. Total antibody titers increased sequentially (up to 1:32.000) as this combination of antigens where being inoculated subcutaneously in the form of recombinant proteins (two doses) or adenoviruses (final booster dose). Of interest, antibody titers were intensely boosted after the challenge with live parasites. Immunofluorescence antibody titers were also high (1:12.000) and highly specific against P. vivax merozoites fixed in microscopic slides. When we looked at the cytokines secreted after immunization, we could observe an increase of IFN? and IL-2 concentrations in the supernatant of stimulated PBMCs from immunized monkeys. However, no statistical significance could be achieved during mathematical analyses. Parasitemia was also analyzed in all immunized animals after a challenge with live P. vivax parasites. The main fact observed was that the best immunized monkeys where better protected, as shown by a decrease in peak parasitemia levels as well as a decreased infection time, which never surpassed day 18 from onset in immunized animals, while it was patent up to day 28 in control animals. No sterile protection could be achieved with our vaccine formulation.In an attempt to further improve our vaccine formulation, MAEBL, a new antigen present in both the liver and blood-stages was also studied. First, we analyzed in silico the putative gene of MAEBL by comparison with previously-published P. yoelii MAEBL sequences. A gene, codon-optimized for expression in eukaryotic cells, was synthesized and incorporated into type 5 replication-deficient adenoviral vector genome. Initial RNA-transcription and translation tests were carried out, indicating a correct production of both the messenger RNA encoding the transgene, as well as the recombinant Pv-MAEBL protein. C57BL/6 mice inoculated with 10exp8 plaque forming units of this viral vector were partially protected against a cross-challenge with live P. yoelii rodent parasites, indicating not only that the new vaccine candidate is immunogenic but also that it induces cross-protection between both Plasmodium species. Our study demonstrated that we were able to generate a candidate vaccine formulation with capacity to partially protect against malaria, and we are devoting our efforts to further improve this formulation by the addition/exchange of new vaccine candidates, including MAEBL and/or other antigens to perform future P. vivax vaccine tests