Expression, Purification and Characterization of Complement Factor H and Apolipoprotein E

In humoral innate immune response, the complement system is a central player. It attacks immediately microbes and foreign particles invading the human body. It is constantly active in plasma and can easily be activated on self surfaces and thereby trigger local inflammation if efficient regulators are missing. Complement factor H (CFH) is one of the main complement regulators in plasma and it has been recently shown to interact with apolipoprotein E, a multifunctional protein mostly associated with lipid metabolism thereby reducing complement activation in plasma. This Bachelor thesis project was initiated to learn more about the mechanism of binding between Complement factor H (CFH) and apolipoprotein E (apoE). The experiments were performed at Helsinki University, Research Programs Unit, Department of Bacteriology and Immunology. The laboratory work was done as a part of Jokiranta group’s research. The aim of this study was to express a recombinant fragment of CFH domains 5-7, obtain high-expressing CFH 5-7 Pichia Pastoris clone and isolate apoE from human very low density lipoprotein (VLDL) and intermediate density lipoprotein (IDL) particles. These isolated molecules will be used in a study investigating the role of CFH and apoE in reducing complement mediated inflammation at early stages of atherosclerosis development. In this thesis the cloning, production and purification of CFH fragment containing three domains (CFH 5-7) and apoE isolation from human VLDL and IDL particles are described. The CFH 5-7 expression process was performed successfully with a maximum protein purity expression. The total amount of the expressed CFH 5-7 (~400 µg) was sufficient to perform further experiments. Further optimization of the plasmid transformation procedure will be needed to obtain high-expressing CFH 5-7 Pichia Pastoris clone in the future.Komplementtisysteemi on humoraalisen synnynnäisen immuunivasteen keskeinen toimija. Se hyökkää välittömästi niitä mikrobeja ja vieraita aineita vastaan, jotka tunkeutuvat elimistöön. Se toimii plasmassa jatkuvasti, ja sitä voidaan aktivoida helposti itsepinnoilla ja siten se laukaisee paikallisen tulehduksen, jos tehokkaat säätävyysmekanismit puuttuvat. Komplementtifaktori H (CFH) on yksi tärkeimmistä komplementtisäätelytekijöistä plasmassa, ja sen on viime aikoina osoitettu olevan vuorovaikutuksessa apolipoproteiini E:n kanssa, joka on useimmiten lipidien metaboliaan liittyvä multifunktionaalinen proteiini, prosessissa, joka vähentää komplementin aktivoitumista plasmassa. Tämä tutkimus aloitettiin, koska haluttiin tutkia sitoutumismekanismia komplementtifaktori H:n (CFH) ja apolipoproteiini E:n (apoE) välillä. Tutkimuksia suoritettiin Helsingin yliopiston Bakteriologian ja Immunologian tutkimusohjelmayksikössä. Laboratoriotyö tehtiin Jokiranta-ryhmän tutkimuksen osana. Opinnäytetyön tavoitteena oli ilmentää komplementtifaktori H:n 5–7 domeenia, saada CFH 5–7:n korkeailmentävä Pichia pastoris -klooni ja eristää apoE:ta ihmisen hyvin alhaisen tiheyden lipoproteiinin (VLDL) ja välituotetta lipoproteiinin (IDL) partikkeleista. Näitä eristettyjä molekyylejä käytetään tutkimuksessa, jossa selvitetään CFH:n ja apoE:n roolia ateroskleroosin alkuvaiheessa komplementtivälitteisen tulehduksen vähentämisessä. Tässä työssä on kuvattu CFH:n 3-domeenin fragmentin (CFH 5–7) kloonaus, tuotanto ja puhdistus ja apoE:n eristäminen ihmisen VLDL- ja IDL-partikkeleista. CFH 5–7:n ilmentymisen menetelmä suoritettiin onnistuneesti. Tätä varten maksimimäärä puhtainta proteiinia ilmennettiin. CFH 5–7:n kokonaismäärä (~400 µg) oli riittävä lisäkokeille. Lisää plasmidimuunnosmenettelyn optimointia tarvitaan, jotta saataisiin korkeaa määrää ilmentävä CFH 5-7 Pichia Pastoris -klooni tulevaisuudessa