Effective bioethanol production from Plant-based biomass by genetically modified yeast strains

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em PlantasThe exponential use and depletion of fossil fuels reserves have brought to light several environmental and economic concerns. Bioethanol is of major importance in achieving an efficient alternative source of energy, being renewable and environmentally sustainable. The selection of robust yeast strains as chassis for metabolic engineering could contribute to attain a cost-effective lignocellulosic bioethanol processing. In this selection, the background of metabolic engineering strains for xylose fermentation could play an important role, being necessary the evaluation of fermentation performance in several stress environments related with the lignocellulosic bioethanol processing. In this work, four robust yeast chassis isolated from industrial environments – PE-2, CA11, CAT- 1 and CCUG53310 – were engineered with the same xylose metabolic pathway. The recombinant strains were physiologically characterized in synthetic xylose and xylose-glucose medium, on nondetoxified hemicellulosic hydrolysates of two fast growing hardwoods (Eucalyptus globulus and Paulownia tomentosa) and agricultural residues (corn cob and wheat straw) and on E. globulus hydrolysate at different temperatures. Similar rates of xylose consumption in presence or absence of glucose in synthetic media were obtained by PE-2-X-dGRE and CA11-X, showing co-fermentation of both sugars. On the other hand, CAT-1-X was capable of utilize xylose, but only after glucose depletion, while CCUG53310-X exhibited extreme deficiency in xylose utilization. Low-cost supplementation by agro-industrial residues of hydrolysate fermentation media demonstrated to be a great substitute for commercial supplements which could reduce operational cost of process. All of the strains tested were able to efficiently ferment the different hydrolysates. The highest ethanol yield (0.46 g/g) from Paulownia hydrolysate was obtained by PE-2-X-dGRE3 within 24 h of fermentation at 30 ºC. In fact, this strain showed superior fermentation ability in all the hydrolysates. Nevertheless, an evaluation of thermotolerance of strains showed that, CA11-X exhibited clearly best performance than PE-2-X-dGRE3 at 40 ºC, utilizing all xylose present in the medium. Results here presented demonstrate that the genetic background of the chassis strains plays a major role on their capacity to metabolize xylose, which was here proved to be dependent of the inhibitory composition of the lignocellulosic hydrolysate as well as of the temperature conditions of the fermentation process. These heterogeneous outcomes highlight the importance of carefully addressing the engineering of yeast strains for efficient lignocellulosic ethanol production.O uso e a redução exponencial de combustíveis fósseis trouxeram vários problemas a nível económico e ambiental. O bioetanol é considerado muito importante para alcançar uma fonte de energia eficiente, sendo renovável e ambientalmente sustentável. A seleção de estirpes de levedura robustas como base para engenharia metabólica pode contribuir para alcançar um processo de bioetanol lignocelulósico rentável. Nesta seleção, o background de estirpes geneticamente modificadas para a fermentação de xilose pode desempenhar um papel importante, sendo necessária a avaliação da performance de fermentação em várias condições de stress relacionadas com o processamento de bioetanol lignocelulósico. Neste trabalho, quatro estirpes de Saccharomyces cerevisiae – PE-2, CA11, CAT-1 e CCUG53310 – foram geneticamente modificadas com a mesma via metabólica para o consumo de xilose. As estirpes recombinantes foram caracterizadas fisiologicamente em meio sintético de xilose e glucose-xilose, em hidrolisados hemicelulósicos não-detoxificados de duas madeiras de rápido crescimento (Eucalyptus globulus e Paulownia tomentosa) e dois resíduos de agricultura (palha de trigo e espiga de milho) e em hidrolisado de E. globulus a diferentes temperaturas. Taxas de consumo de xilose semelhantes na presença ou ausência de glucose em meios sintéticos foram obtidas pelas estirpes PE-2-X-dGRE e CA11-X, mostrando co-fermentação de ambos os açúcares. Por outro lado, CAT-1-X foi capaz de utilizar a xilose, mas apenas após a depleção da glucose, enquanto que CCUG53310-X mostrou grande deficiência na utilização de xilose. Suplementação low-cost com resíduos agroindustriais em fermentações de hidrolisados mostraram ser bons substitutos para suplementos comerciais, o que reduziria os custos do processo. Todas as estirpes testadas foram capazes de fermentar os diferentes hidrolisados. A maior taxa de produção de etanol (0.46 g/g) em Paulownia foi obtida pela PE-2-X-dGRE3 em 24h, a 30 ºC, que mostrou superior de capacidade de fermentação em todos os hidrolisados. No entanto, numa avaliação da termotolerância das estirpes, CA11-X mostrou claramente uma melhor performance do que PE-2-XdGRE3 a 40 ºC, utilizando toda a xilose presente no meio. Os resultados aqui apresentados demonstram que o background genético das estirpes desempenha um papel importante na sua capacidade de metabolizar xilose, tendo sido provado que está dependente da inibição da composição de hidrolisados lignocelulósicos, bem como das condições térmicas e do processo de fermentação. Estas consequências heterogéneas destacam a importância de delinear cuidadosamente a engenharia genética das estirpes de leveduras para a produção eficiente de etanol lignocelulósico.This work was support by the Strategic Project of UID/BIO/04469/2013 CEB Unitsd