Multifunctional silk fibroin-based constructs for tissue engineering and regenerative medicine applications

Tese de Doutoramento (Programa Doutoral em Engenharia de Tecidos Medicina Regenerativa e Células Estaminais)Osteochondral (OC) defects are a common problem in orthopedics, affecting simultaneously the articular cartilage and underlying subchondral bone tissue. In order to repair an OC defect, the needs of cartilage, bone and bone-cartilage interface must be considered. OC tissue engineering (TE) strategies may include the use of biomaterials processed into porous scaffolds, fiber materials or hydrogels. Bilayered scaffolds, developed by combining these structures into layered and graded forms, have been receiving much attention (Chapter 1). While the ideal TE strategy has not yet been achieved, great efforts have been made in terms of pre-clinical and clinical applications of engineered biomaterials for OC regeneration, some of them overviewed in this thesis (Chapter 2). As a natural-based polymer silk fibroin (SF) has a particular interest as scaffolding material. The most recently developed biomimetic strategies and processing routes of SF-based materials aiming bone, cartilage and OC tissues regeneration, were summarized and discussed in this thesis (Chapter 3). The high processability of this protein, also motivated the use of silk in the herein developed work. Textile-based SF scaffolds were produced by a weft-knitting technology and surface modified to be modulated according to the target TE application (Chapter 5). The same textile-based technology was used to process novel weft-knitted SF spacer scaffolds for bone TE applications (Chapter 6). A monofilament of polyethylene terephthalate (PET) was used to increase the scaffolds three-dimensionality (3D), inducing structural similarities adequate for flat bone regeneration. A horseradish peroxidase (HRP)-mediated crosslinking system was used in combination with salt-leaching and freeze-drying methodologies for preparing porous SF scaffolds for cartilage TE applications (Chapter 7). Considering the stratified and hierarchical characteristics of OC tissue, bilayered scaffolds composed of a HRP-crosslinked SF layer and a composite layer combining HRP-crosslinked SF and ionic-doped (zinc and strontium) β-tricalcium phosphate (β-TCP), were proposed for OC regeneration (Chapter 8). The use of HRP-crosslinked SF hydrogels with spatial tunable properties and cell-encapsulation ability, was also proposed in this thesis as a novel strategy for the fundamental study of hydrogel-based 3D models in cancer research (Chapter 9). In summary, the presented results indicated the versatility of the proposed biomimetic strategies for improving the performance of SF as biomaterial for bone, cartilage and OC tissue engineering, or for using in 3D culture technologies to build better in vitro 3D tumor models for cancer research.Defeitos osteocondrais são dos maiores problemas em cirurgia ortopédica, afetando em simultâneo a cartilagem articular e o tecido ósseo subcondral adjacente. A reparação destes defeitos, envolve ações no osso, cartilagem e na interface que os une, sendo que diferentes abordagens em engenharia de tecidos e uso de biomateriais foram já propostas nesse sentido. Biomateriais porosos, à base de fibras, hidrogéis e estruturas em bicamada, foram já explorados para engenharia do tecido osteocondral (Capítulo 1), e apesar de não ser reconhecida a estratégia ideal para a reparação deste tecido, avanços significativos têm sido demonstrados em estudos pré-clínicos e clínicos (Capítulo 2). A fibroína da seda (Silk Fibroin - SF) tem sido proposta em algumas estratégias envolvendo biomateriais para aplicações no osso, cartilagem ou tecido osteocondral, algumas descritas nesta tese (Capítulo 3). A elevada processabilidade da SF suscitou o interesse da sua aplicação neste trabalho. Através da tecnologia têxtil weft-knitting, foi possível produzir novas estruturas à base de SF capazes de serem modificadas superficialmente de acordo com a aplicação desejada (Capítulo 5). Estruturas de SF weftknitted foram também utilizadas em combinação com um monofilamento de politereftalato de etileno (PET), para produzir biomateriais porosos com superior tridimensionalidade e semelhanças estruturais ao osso achatado (Capítulo 6). Um sistema de reticulação enzimática com base na enzima peroxidase (Horseradish peroxidase - HRP) foi proposto para reticulação da SF, e em combinação com metodologias de salt-leaching e freeze-drying formar estruturas porosas para aplicações na cartilagem (Capítulo 7). Tendo em conta as propriedades estratificadas e hierárquicas do tecido osteocondral, estruturas em bicamada foram também desenvolvidas, envolvendo uma camada condral porosa de SF reticulada enzimaticamente e uma camada subcondral em que as mesmas estruturas foram incorporadas com partículas de β-tricálcio fosfato (β-TCP) dopadas com iões zinco e estrôncio (Capítulo 8). Hidrogéis de SF reticulados pela HRP foram também desenvolvidos com propriedades estruturais ajustáveis e capacidade de encapsulamento celular, propostos nesta tese para o estudo fundamental de modelos 3D com base em hidrogéis, na investigação do cancro (Capítulo 9). Em suma, os resultados obtidos demonstram a versatilidade das estratégias biomiméticas propostas, de modo a melhorar as propriedades dos biomateriais de SF para aplicações na engenharia do tecido ósseo, cartilagem e osteocondral, ou para aplicações na investigação do cancro como tecnologias 3D que mimetizem o microambiente tumoral in vitro