EFEITOS In Vitro da Triiodotironina na Diferenciação condrogênica das Células-tronco Mesenquimais da Medula óssea de Ratas

Os hormônios tireoidianos influenciam in vivo o crescimento ósseo, pois regulam os processos de diferenciação e maturação dos condrócitos da zona hipertróficada placa epifisária e em culturas de condrócitos e de ATDC cells estimulam a maturação dessas células. Além disso, como tanto as células tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) quanto do tecido adiposo (CTM-TA) podem dar origem aos condrócitos, é provável que essas células respondam à adição de T3 com aumento da diferenciação condrogênica. Assim, o objetivo deste projeto será estudar o efeito in vitro da T3 na diferenciação condrogênica de CTM-MO e de CTM-TA, durante vários períodos e em várias doses. Serão utilizadas seis ratas Wistar com um mês de idade que serão eutanasiadas com sobredose de anestesia e, imediatamente após este procedimento, seus ossos longos (fêmur e tíbia) serão colhidos assepticamente e submetidos à extração da medula óssea para obtenção de um pool de células. Além dos ossos, será colhido assepticamente o tecido adiposo visceral para obtenção de um pool de células. As CTM-MO e as CTM-TA serão cultivadas in vitro em meio de indiferenciação para avaliação da caracterização fenotípica por citometria de fluxo e da viabilidade celular pelo uso da técnica de coloração pelo azul de Tripan. Posteriormente, as células serão cultivadas em meio de diferenciação condrogênico, acrescido ou não de 3,3,5-triiodo-L-tironina (T3), dependendo do grupo. Serão constituídos dez grupos experimentais cultivadas em meio condrogênico: 1) CTM-MO sem T3; 2) CTM-TA sem T3; 3,4,5,6) CTM-MO tratadas com T3 (0,01; 1; 100; 1000nM); 7,8,9,10) CTM-TA tratadas com T3 (0,01; 1; 100; 1000nM). Após sete, 14 e 21 dias de diferenciação serão avaliados: a conversão do substrato dimetiltiazol (MTT) em cristais de formazan, a celularidade, a expressão de Sox-9, Runx-2, Agrecano, colágeno II e colágeno X, Caspase-3 e fosfatase alcalina, por RT-PCR em tempo real e, a análise histomorfométrica das células (formação de matriz cartilaginosa). Será realizado cultivo de condrócitos que serão utilizados como controle positivo da diferenciação condrogênica. Todos os ensaios in vitro, serão realizados com seis repetições em cada grupo e em cada período. Para análise dos resultados, os dados serão submetidos à análise de variância ANOVA e as médias serão comparadas pelo teste de Student-Newman Keuls (SNK). Todos os procedimentos experimentais serão executados segundo as recomendações e a aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Espírito Santo