Flavin-binding fluorescent proteins as genetically encoded singlet oxygen photosensitizers

Aquesta tesi profunditza en l'estudi de les proteïnes fluorescents que uneixen flavina com a fotosensibilitzadors d'oxigen singlet codificables genèticament per a la teràpia fotodinàmica. Els fotosensibilitzadors biològics són una alternativa poderosa als fàrmacs convencionals sensibles a la llum degut a la major especificitat front a cèl·lules sanes i a la capacitat d’acumular-se preferentment en orgànuls crítics, gràcies al control genètic de l'expressió cel·lular. Una nova família de proteïnes fluorescents que contenen mononucleòtid de flavina com a cromòfor ha despertat molt d’interès ja que produeixen majors quantitats d'oxigen singlet que la proteïna verda fluorescent i els seus derivats. En aquest treball s'han avaluat les propietats fotofísiques, fotosensibilitzants i antimicrobianes d'onze flavoproteïnes provinents de diferents organismes. Totes les proteïnes estudiades són capaces de produir oxigen singlet i la majoria són altament fototòxiques quan s'expressen en cèl·lules E. coli. Malgrat que comparteixen el mateix cromòfor, les propietats fotofísiques de les proteïnes difereixen notablement d'una a l'altra. Per exemple, algunes són fotosensibilitzadors eficients i són capaces de provocar la mort de cèl·lules bacterianes però fotoblanquegen ràpidament. D’altres produeixen petites quantitats d'oxigen singlet però exhibeixen una elevada fotostabilitat. Els resultats presentats en aquest treball amplien el ventall de flavoproteïnes fotoactives i proporcionen una guia útil per triar la millor opció per a cada aplicació. MiniSOG va ser la primera flavoproteïna desenvolupada racionalment amb l’objectiu de produir d'oxigen singlet. Des de llavors ha estat emprada en nombrosos estudis, però les seves propietats fotoquímiques són complexes i encara resten qüestions pendents de resoldre. Mitjançant estudis estructurals i espectroscòpics s’ha aconseguit racionalitzar la seva modesta producció d’oxigen singlet, dilucidar les transformacions que experimenta quan s’irradia amb llum i establir una base científica sòlida pel desenvolupament racional de nous fotosensibilitzadors d'oxigen singlet codificats genèticament. Així mateix, s'han caracteritzat nous mutants de miniSOG més eficients, així com heterodímers de flavoproteïnes que combinen propietats fotofísiques complementàries. També s’ha demostrat que miniSOG i certs mutants indueixen selectivament la mort de cèl·lules de mamífer quan s’il·luminen amb llum blava, i que és possible combinar proteïnes fotoactives amb reporters fluorescents de processos cel·lulars. L'aplicació de la teràpia fotodinàmica pel tractament del melanoma continua sent un dels principals reptes biomèdics. En aquest estudi, s’ha proposat utilitzar miniSOG per tractar cèl·lules de melanoma. Lamentablement, no ha estat possible comprovar l’expressió correcta de la proteïna fotoactiva, pel que no s’ha pogut avaluar la idoneïtat de la proposta ni extreure’n conclusions.Esta tesis profundiza en el estudio de proteínas fluorescentes que unen flavina como compuestos fotosensibilizadores de oxígeno singlete codificables genéticamente para su uso en terapia fotodinámica. Los fotosensibilizadores biológicos son una poderosa alternativa a los fármacos convencionales sensibles a la luz debido a su mayor especificidad frente a células sanas y a su capacidad para acumularse en orgánulos críticos, gracias al control genético de la expresión celular. Una nueva familia de proteínas fluorescentes que encapsulan el mononucleótido de flavina ha despertado un gran interés por su mayor capacidad de generar oxígeno singlete en comparación con la proteína verde fluorescente y sus derivados. En este trabajo se han evaluado las propiedades fotofísicas, fotosensibilizantes y antimicrobianas de once flavoproteínas provenientes de diferentes organismos. Todas ellas producen oxígeno singlete y la mayoría son altamente fototóxicas una vez expresadas en células E. coli. Aunque comparten el mismo cromóforo, las propiedades fotofísicas difieren notablemente de una a otra proteína. Por ejemplo, algunas son fotosensibilizadores eficientes y destruyen las células bacterianas, pero fotoblanquean rápidamente. Otras producen pequeñas cantidades de oxígeno singlete, pero son más fotoestables. Los resultados obtenidos amplían el abanico de flavoproteínas fotoactivas disponibles y proporcionan una guía útil para elegir la mejor opción para cada aplicación. MiniSOG fue la primera flavoproteína racionalmente desarrollada para generar oxígeno singlete. A pesar de haber sido analizada en numerosos estudios, su fotoquímica es compleja y hay observaciones controvertidas e incógnitas que restan por resolver. Su caracterización estructural y espectroscópica ha permitido comprender los factores que limitan su modesta producción de oxígeno singlete, dilucidar las transformaciones que sufre bajo irradiación y establecer una base científica sólida para el desarrollo de nuevos fotosensibilizadores codificados genéticamente. Además, se han caracterizado nuevos mutantes de miniSOG más eficientes así como heterodímeros de flavoproteínas que combinan propiedades fotofísicas complementarias. También se ha demostrado que miniSOG y ciertos mutantes inducen selectivamente la muerte de células de mamífero cuando se iluminan con luz azul y que es posible combinar proteínas fotoactivas con reporteros fluorescentes de procesos celulares. La aplicación de la terapia fotodinámica para el tratamiento del melanoma sigue siendo uno de los principales desafíos en la biomedicina. En este estudio se ha propuesto la expresión de miniSOG para tratar celulas de melanoma. Sin embargo, no ha sido posible comprobar la expresión correcta de la proteína fotoactiva, por lo que no se ha podido evaluar la idoneidad del enfoque ni sacar conclusiones adicionales.This thesis reports the study of flavin-binding fluorescent proteins as genetically encodable singlet oxygen photosensitizers in photodynamic therapy. Biological photosensitizers are a powerful alternative to conventional light-sensitive drugs owing to their superior targeting potential and localized accumulation in critical organelles, conferred by the genetic control of cell expression. A novel family of fluorescent proteins encasing flavin mononucleotide as the chromophore is gaining much attention since flavoproteins produce higher amounts of singlet oxygen than the proteins derived from the green fluorescent protein family. In this work, the photophysical, photosensitizing and antimicrobial properties of eleven flavoproteins derived from different organisms have been evaluated. All the proteins studied are capable of producing singlet oxygen and most of them are highly phototoxic when expressed in E. coli cells. Although they encase the same chromophore, their photophysical properties differ remarkably from one protein to another. For example, some of them are efficient photosensitizers and kill bacterial cells but show rapid photobleaching. Others produce little amounts of singlet oxygen but exhibit high photostability. The results presented herein expand the toolbox of photoactive flavoproteins and provide valuable guides for choosing the best candidate for a given application. MiniSOG was the first flavoprotein rationally developed for singlet oxygen applications. Since then, it has been a matter of intense research; however, its photochemistry is complex and a number of controversial observations and fundamental questions remain unexplained. The combination of structural and spectroscopic studies has allowed to rationalize its modest singlet oxygen production, elucidate the transformations that it undergoes upon photolysis and establish a sound scientific basis for the rational design and development of new genetically encoded singlet oxygen photosensitizers. Novel miniSOG mutants with improved photosensitizing properties have been characterized as well as flavoprotein heterodimers that combine complementary photophysical properties. It has also been demonstrated that miniSOG and selected mutants induce mammalian cell killing selectively upon light exposure and that it is possible to combine photoactive proteins with fluorescent cell reporters. The application of photodynamic therapy for the treatment of melanoma remains one of the main challenges in the biomedical sciences. In this study, miniSOG has been selected to test the suitability of the genetically encoded approach in melanoma cell lines. Unfortunately, it has not been possible to ascertain the correct expression of the photoactive protein, which has prevented further studies and the possibility of drawing conclusions