Bases moleculares de los mecanismos de osmorregulación en bacterias halófilas moderadas

Durante la última década, nuestro Equipo de Investigación ha realizado numerosos estudios encaminados a un mejor conocimiento de la biología de las bacterias halófilas moderadas, procariotas que conjuntamente con las arqueas aerobias halófilas extremas, son los microorganismos más representativos de los ambientes hipersalinos. En concreto, las bacterias halófilas moderadas predominan en medios con un 3-15% de sal, presentando un crecimiento óptimo a una concentración de un 10% de sal (Ventosa y col., 1998). Si bien la mayoría de estos estudios se han centrado en su taxonomía, filogenia, ecología y fisiología, solo hasta muy recientemente se han abordado estudios relativos a su genética, pudiéndose considerar estudios pioneros en dicho campo. Así dichos estudios han permitido el desarrollo de las herramientas necesarias para la manipulación genética de estos microorganismos extremófilos, habiéndose caracterizados a nivel molecular una serie de plásmidos nativos que han permitido la construcción de diversos vehículos de clonación, así como la optimización de los sistemas y condiciones de transferencia genética por conjugación entre bacterias halófilas moderadas y bacterias no halófilas. El estudio de la genética de estos microorganismos posee un gran interés aplicado, ya que dichas bacterias no sólo son importantes por el papel ecológico que desempeñan en los alimentos hipersalinos que habitan, sino también por su gran potencial biotecnológico. Además de producir exoenzimas de interés industrial del tipo de las amilasas, fosfatasas, nucleadas y proteasas, acumulan una serie de compuestos osmoprotectores o solutos compatibles (Ventosa y col., 1998). Estos solutos compatibles, que constituyen un mecanismo de defensa frente a la baja actividad e agua presente en este tipo de ambientes, han demostrado desempeñar una función estabilizadora y protectora de enzimas y células frente a elevadas salinidades, desnaturalización por calor, desecación y procesos de congelación/descongelación. De hecho recientemente se ha comercializado un “coktail” de compuestos orgánicos con funciones protectoras y estabilizadoras, que contiene ectoína e hidroxiectoína, entre otros solutos compatibles. Sin embargo, la producción a gran escala de estos solutos compatibles todavía es costosa y poco eficiente. Por lo tanto, se necesita de la manipulación genética de las cepas productoras de ectoína para conseguir la optimización de este proceso. Por otro lado, y dada la enorme capacidad de tolerancia a la sal que poseen este tipo de microorganismos, el aislamiento de los genes responsables de esta tolerancia alcanza un gran interés. En primer lugar, su estudio contribuiría a clarificar los mecanismos de osmorregulación y osmoadaptación en bacterias. Estos procesos han sido intensamente estudiados en bacterias no halófilas, cuya capacidad de tolerancia a la sal es muy limitada (Csonka y Epstein, 1996). Sin embargo e incongruentemente, los conocimientos que se tienen en las bacterias halófilas es muy escaso. Estos mecanismos forman un entramado extraordinariamente complejo, que la comunidad científica todavía no ha podido aclarar en su totalidad. Su estudio en bacterias halófilas moderadas, donde estos mecanismos coexisten continuamente con el funcionamiento normal celular, puede aportar conocimientos muy valiosos que ayuden a dilucidar este entramado. En segundo lugar, la clonación de los genes con capacidad para conferir una mayor tolerancia a la sal a diversos hospedadores abre un nuevo camino en la construcción de organismos más versátiles. De esta forma, podrían utilizarse plantas transgénicas resistentes a bajas concentraciones de agua en suelos salinos y/o desérticos. Por otro lado, podrían construirse, mediante ingeniería genética, microorganismos de interés industrial que tuvieran aumentadas sus capacidades de desarrollarse en medios con mayor salinidad, reduciendo los riesgos de contaminaciones. Como consecuencia de lo anteriormente expuesto, el objetivo del presente trabajo es la caracterización fisiológica y genética de los procesos de osmorregulación en bacterias halófilas moderadas. Para ello, se ha seleccionado a la bacteria halófila moderada Halomonas elongata como organismos modelo. Aunque los estudios realizados con esta especie son relativamente escasos, es, junto con Salinivibrio costicola¸ la especie más estudiada de las bacterias halófilas moderadas. La razón de ello es su facilidad para ser cultivada en el laboratorio, junto con su amplísimo rango salino (de 0,06 a 5,5 M de NaCl en medio complejo) (Vreeland y col., 1980), lo que la convierten en el modelo ideal para estudiar los mecanismos de osmorregulación a nivel genético. Debido a la falta de información existente sobre estos procesos, la primera etapa del presente Trabajo consistió en la determinación de los mecanismos de osmoprotección que posee Halomonas elongata, así como su caracterización bioquímica. De esta forma, se prestó especial atención a los dos mecanismos menos estudiados en bacterias halófilas moderadas: el transporte y la síntesis de betaína. En segundo lugar, se acometió la caracterización genética de los sistemas implicados. Su estudio se abordó siguiendo dos líneas principales: aislamiento y caracterización de mutantes de Halomonas elongata sensibles a la sal, y la clonación de genes mediante la complementación de mutantes de la bacteria no halófila E. coli. El sistema de síntesis de betaína se escogió como modelo para un estudio más profundo de los genes. En tercer lugar, se analizó la capacidad osmoprotectora del ácido Nγ-acetildiaminobutírico, el precursos de la ectoína, que es acumulado como soluto mayoritario por un mutante Ect-. Puesto que no existe un único sistema responsable de la halotolerancia en Halomonas elongata, consideramos oportuno la realización de un estudios de varios sistemas en paralelo. Así, aunque se ha descrito la ruta biosintética de la ectoína (Peters y col., 1990), no se ha descrito la existencia de otros sistemas tales como el transporte y la síntesis de betaína en Halomonas elongata. El funcionamiento de estos dos sistemas en Halomonas elongata se demostrará. Por otro lado, en el presente trabajo se obtendrán mutantes sensibles a una elevada salinidad afectados en la síntesis de ectoína. Asimismo, se abordará el aislamiento y caracterización de los genes responsables de los tres mecanismos de osmoadaptación caracterizados desde el punto de vista fisiológico; estos son: síntesis de ectoína, transporte de betaína y oxidación de colina a betaína