Metagenomics for enzyme bioprospection

Dissertação de mestrado em Genética MolecularAs enzimas são catalisadores biológicos que aceleram reações químicas, sendo usadas diariamente numa ampla gama de indústrias. Ao nível industrial apresentam inúmeras vantagens, melhorando a eficiência dos processos, a relação custo-eficácia, o impacto ambiental, além de melhorar as características e a qualidade do produto. Atualmente há uma grande necessidade de identificar e desenvolver novas enzimas, com propriedades ajustadas às necessidades das indústrias e que potenciem melhorias significativas nos seus produtos. No entanto, as abordagens baseadas na cultura tradicional de microrganismos para identificação enzimática apresentam várias limitações. Estima-se que, com base neste método, apenas 1% da população microbiana pode ser cultivada em laboratório e detetada com sucesso. Em alternativa, a metagenómica permite uma abordagem independente de cultura para a bioprospecção enzimática. Esta é uma técnica que permite o isolamento direto e a análise do DNA diretamente a partir do ambiente e, portanto, permite um maior acesso à diversidade microbiana e à identificação do repertório enzimático da população microbiana. Neste projeto, foi utilizada uma abordagem metagenómica desenvolvida na Escola de Microbiologia da University College Cork, na Irlanda. Desta forma foi efetuado o rastreio de várias amostras marinhas de esponjas e amostras de solo, para a presença de 6 tipos de enzimas hidrolíticas de interesse industrial: lipases, fosfolipases, lactases, pectinases, xilanases e celulases. Foram selecionados 11520 clones de cada biblioteca metagenómica para cada uma das atividades hidrolíticas investigadas. O rastreio funcional permitiu a identificação de 3 lipases, 29 lactases, 23 pectinases e 63 fosfolipases hipotéticas. Posteriormente, foram selecionadas 21 sequências de inserção para sequenciação e anotação e, curiosamente, foram apenas identificadas ORFs (open reading frame) que codificavam 1 hipotética lipase e 1 hipotética fosfolipase, o que parece indicar que as outras atividades enzimáticas detetadas são falsos positivos ou que são, de facto, genes que codificam sequências correspondendo a novas estruturas. Além disso, a análise das sequências de inserção indicou a presença de três novas sequências hipotéticas de celulases, ainda que com baixa identidade. Finalmente, foram selecionadas uma lipase, uma fosfolipase e uma celulase para estudos posteriores, e o trabalho inicial permitiu a amplificação bem-sucedida das sequências desses genes. O trabalho futuro deverá concentrar-se na clonagem, sobreexpressão e caracterização destas enzimas, bem como na confirmação e análise das outras atividades funcionais identificadas.Enzymes are biological catalysts that speed up chemical reactions and are commonly used in a wide range of industries on a daily basis. They offer advantages to industry by improving process efficiency, cost effectiveness and environmental impact as well as by enhancing product characteristics and quality. Novel enzymes with novel properties and enhanced, industry relevant, performance are constantly called for, but traditional culture based approaches for enzyme identification have been found to be severely limited. Currently, it is estimated that only 1% of the microbial population can be successfully cultured and screened. On the other hand, metagenomics allows for a culture independent approach for enzyme bioprospection. It is a powerful technique which allows for the direct isolation and analysis of DNA from an environment and hence enables a greater access to microbial diversity and the exploration of the enzymatic repertoire of the microbial population. In this project, a metagenomics approach developed at the School of Microbiology at University College Cork, Ireland was used to screen a number of deep sea sponge and soil samples for 6 hydrolytic enzymes of industrial interest: lipases, phospholipases, lactases, pectinases, xylanases and cellulases. 11520 metagenomic library clones were screened for each hydrolytic activity investigated with each environmental sample. High throughput functional screening allowed for the identification of 1 lipase, 29 lactases, 23 pectinases and 63 hypothetical phospholipase activities. 21 insert sequences were selected for sequencing and annotation and, interestingly, open reading frames encoding only 1 hypothetical lipase and 1 hypothetical phospholipase were identified. This would indicate that the other activities detected are either false positives or are due to genes encoding truly novel sequences with new backbones. In addition, sequence analysis indicated the presence of three novel hypothetical cellulase sequences with low homology to cellulases. 1 lipase, 1 phospholipase and 1 cellulase were selected for further studies and initial work allowed for the successful amplification of the gene sequences of these. Future work should focus on the cloning, overexpression and characterisation of these as well as the confirmation and analysis of the other functional activities identified