Estudio genético y bioquímico de OmpL de Salmonella enterica serovar Typhimurium: posible función como canal involucrado en la expulsión de compuestos oxidados y/o reducidos desde el periplasma de la bacteria

Tesis (Doctor en Biotecnología)RESUMEN: Las porinas son proteínas de membrana externa, que forman canales acuosos que permiten el paso de solutos hidrofílicos, tóxicos y nutrientes a través de la membrana externa de la bacteria. En el estado normal de desarrollo de Salmonella enterica serovar Typhimurium, esta bacteria necesita importar nutrientes y exportar desechos, entre estos últimos, un tercio corresponde a intermediarios metabólicos tóxicos. Para esto, el 10 % del genoma de Salmonella codifica para los componentes de los diferentes sistemas de transporte. Por razones de economía celular muchos de estos sistemas tendrían una función dual tanto en importación como exportación de moléculas. Evidencia experimental reportada en la literatura y obtenida en nuestro laboratorio señalan que, la expresión de las porinas es modulada por especies reactivas de oxígeno y ensayos de transporte in vivo e in vitro, indican que estas proteínas son requeridas en la difusión de estos compuestos tóxicos. En esta Tesis determinamos que la capacidad de modular el estatus redox del periplasma está mediada por la difusión de H2O2 y glutatión al espacio extracelular, a través de la porina OmpL. Por otra parte, se analizó la expresión del gen yshA (ompL) en presencia de H2O2 y se demostró que aumenta los niveles del transcrito. Además, este gen formaría parte de un operón tanto en Salmonella Typhi como en Salmonella Typhimurium; operón que procesaría y transportaría un exopolisacárido encargado de la formación de biofilms en cálculos biliares, como una forma de persistencia dentro del hospedero en el ciclo infectivo de la bacteria y su función estaría mediada por el regulador global CRP. Esta regulación es ejercida en forma directa y positiva en condiciones de ausencia o disminución del represor catabólico, glucosa.ABSTRACT: Porins are outer membrane proteins that form aqueous channels that allow the passage of hydrophilic solutes, toxins and nutrients through the outer membrane of bacteria. In the normal developmental state of Salmonella enterica serovar Typhimurium, the bacteria needs to import nutrients and export waste, of which a third are toxic metabolic intermediates. For this, 10% of Salmonella´s genome encodes for components of different transport systems. For economy reasons many of these cell systems could have a dual function in both the import and export of molecules. Evidence from our laboratory and literature indicates that porin expression is modulated by reactive oxygen species and in vivo and in vitro assays indicate that these proteins are required in the diffusion of these toxic compounds. In this Thesis we determined that ability to modulate the redox status, is mediated by the diffusion of molecules such as H2O2 or glutathione to the extracellular space trough the OmpL porin. On the other hand, the expression of the yshA (ompL) gene was analyzed in presence of H2O2 and we demonstrate that transcript level is increased in response to this toxic compound. Furthermore, this gene is part of an operon in both Salmonella Typhi and Salmonella Typhimurium. This operon could process and transport an exopolysaccharide, responsible for biofilm formation on gallstones as a mode of persistence within the host in the Salmonella’s infective cycle and its function is mediated by the global regulator CRP. This regulation is exerted directly and positively in conditions of absence or diminution of the catabolic repressor, glucose