Rol de GCSF-CHR19; CXCL8a y CXCL8b en la migración de neutrófilos a través de los vasos sanguíneos en pez cebra (Danio rerio)

Tesis (Magíster en Biotecnología)Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico 1171199 y 1150816, Dirección de Investigación UNAB DI-483-14/R, y Fondo de Financiamiento de Centros de Investigación en Áreas Prioritarias 15110027.La migración de neutrófilos es una de las características que distinguen a un proceso inflamatorio, y su desregulación se presenta en diversas enfermedades con componente inmune. Esta tesis se enfocó en estudiar la regulación, a nivel molecular, de la migración de los neutrófilos a los vasos sanguíneos para llegar al lugar de inflamación causada por un daño estéril. En mamíferos, específicamente en ratones, este proceso es regulado por la vía de las citoquinas CXCL1/2 y su receptor CXCR2 y que a su vez están controlados por vía de señalización G-CSF. Por su parte, en humanos, el principal ligando del receptor CXCR2 es CXCL8, pero no se sabe si esta vía de señalización regula la migración de neutrófilos a la circulación sanguínea. Esta diferencia entre el modelo murino y humanos impide el desarrollo de estudios de la mencionada problemática en ratones, por lo que se propone el uso de pez cebra como modelo de estudio alternativo. El pez cebra presenta en su genoma dos parálogos para Cxcl8, Cxcl8a y Cxcl8b. Antecedentes disponibles indican que Cxcl8a regula la migración de neutrófilos durante un proceso inflamatorio y que Cxcl8b aumenta sus niveles transcripcionales en pez cebra. Por su parte, Gcsf-chr19 ejerce una función similar a la descrita para su ortólogo G-CSF en mamíferos. Basado en la problemática antes descrita que se plantea la siguiente hipótesis: “Cxcl8a regula el ingreso de neutrófilos al torrente sanguíneo, en respuesta a un daño mecánico en pez cebra. Esta quimioquina a su vez es regulada por Gcsf-Chr19”. Así, el objetivo general fue caracterizar la función de Cxcl8a y Cxcl8b durante el proceso de migración de neutrófilos a los vasos sanguíneo gatillado por daño estéril en pez cebra y su relación con Gcsf-Chr19. Utilizando larvas doble transgénicas Tg (BACmpx:GFP) i114 X Tg (fli1:EGFP)y1, se llevaron a cabo dos modelos de daño con diferente intensidad (severo y leve), y se monitoreo in vivo la migración de neutrófilos en condiciones de falta de función de Cxcl8a y Cxcl8b. Además, se determinaron los niveles transcripcionales de cxcl8a y cxcl8b, y otros genes involucrados en un proceso inflamatorio tales como: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2, sdf-1, cxcr4, gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88, en ambos tipos de daños y en daño severo en ausencia de Gcsf-chr19. Los resultados obtenidos, indican que, en un proceso inflamatorio gatillado por un daño estéril severo, Gcsf-Chr19 reprime la expresión de sdf-1 e induce la expresion de Cxcl8b y con ello favorece la entrada de neutrofilos a los vasos sanguineos. Por su parte, Cxcl8a regula la migracion de neutrofilos a traves del tejido intersticial.Neutrophils migration is one of the characteristics that distinguish an inflammatory process, and its deregulation occurs in several diseases with immune component. This thesis focused on studying the regulation, at a molecular level, of the migration of neutrophils to blood vessels to reach the site of inflammation caused by sterile damage. In mammals, specifically in mice, this process is regulated by the CXCL1/ 2 cytokine pathway and its receptor CXCR2, and in turn are controlled via GCSF signaling. On the other hand, in humans, the main ligand of the CXCR2 receptor is CXCL8, but it is not known if this signaling pathway regulates the migration of neutrophils into the bloodstream. This deference between the murine model and human prevents the development of studies of the mentioned problem in mice, so it is proposed the use of zebrafish as an alternative study model. The zebrafish presents in its genome two paralogs for Cxcl8, Cxcl8a and Cxcl8b. Available evidence indicates that Cxcl8a regulates neutrophil migration during an inflammatory process and that Cxcl8b increases its transcriptional levels in zebrafish. For its part, Gcsf-chr19 performs a function similar to that described for its orthologous G-CSF in mammals. Based on the above problem, the following hypothesis is proposed: "Cxcl8a regulates the entry of neutrophils into the bloodstream, in response to mechanical damage in zebrafish. This chemokine is regulated by Gsf-Chr19 ". Thus, the aim was to characterize the function of Cxcl8a and Cxcl8b during the process of migration of neutrophils to blood vessels triggered by sterile zebrafish damage and their relationship to Gcsf-Chr19. Using double transgenic larvae, Tg (BACmpx: GFP) i114 and Tg (fli1: EGFP) y1, and two damage models with different intensities (severe and mild), which allowed carried out in vivo monitoring of the migration of neutrophils in Cxcl8a and Cxcl8b lack of function. In addition, measuring of the transcriptional levels of cxcl8a and cxcl8b, and other genes involved in an inflammatory process such as: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2, sdf-1, cxcr4, gcsf-chr12, gcsf-chr19 and myd88, in both types of damages and in severe damage with lack of function of Gcsf-chr19. The results indicate that, in an inflammatory process triggered by severe sterile damage, Gcsf-Chr19 represses the expression of sdf-1 and induces the expression of Cxcl8b and thus favors the entry of neutrophils into the blood vessels. For its part, Cxcl8a regulates the migration of neutrophils through the interstitial tissue