Investigation of the Penicillium chrysogenum derived antifungal protein (PAF) in animal models

A Penicillium chrysogenum által termelt antifungális fehérje (PAF) gátolja a szaporodását fontos pathogén fonalas gombáknak, köztük az Aspergillus család tagjainak és néhány dermatophytonnak. Továbbá a PAF-ról bebizonyították, hogy nincs toxikus hatása emlős sejtekre in vitro. Annak bizonyítására, hogy a PAF biztonságosan használható lehet a humán terápiában, in vivo kísérleteket végeztünk. Felnőtt egereknek adagoltunk PAF-ot intranasalisan különböző koncentrációkban, maximálisan 2700 μg/kg-ig két hétig naponta. Ez a koncentráció már erősen toxikus in vitro az összes használt érzékeny gombafajra. Tömegspektrometriával bizonyítottuk, hogy mérhető mennyiségű PAF halmozódott fel a tüdőkben a kezelés után. A PAF-fal kezelt egerekből származó tüdőszövet kivonatok szignifikáns antifungális aktivitást mutattak. Még a legmagasabb koncentrációnál sem pusztult el egyetlen egy állat sem a kezelés következtében, illetve nem figyeltünk meg mellékhatásokat. Szövettani vizsgálattal nem találtunk patológiás eltéréseket sem a májban, a vesékben, vagy a tüdőkben. Kisállat pozitron emissziós tomográfiával kimutattuk, hogy sem a fiziológiás sóoldat, sem a PAF nem váltott ki gyulladást, míg a lipopoliszacharid igen. A szer bőrre kifejtett hatását megvizsgáltuk, ahol az egerek füleinek vastagsága nem változott PAF kezelés után, míg a pozitív kontroll PMA adása után igen. Mivel nem találtunk toxikus hatást a PAF adagolása során, invazív pulmonalis aspergillosis (IPA) elleni hatékonyságát teszteltük IPA-ban szenvedő egereken. Felnőtt egereket immunszupprimáltunk, majd megfertőztünk Aspergillus fumigatus-szal. A stabil fertőzés létrehozása után, az állatokat PAF-fal kezeltük intranasalisan naponta kétszer 2,7 mg/kg koncentrációban, ami erősen toxikus in vitro A. fumigatusra. Az állatok mortalitása enyhén lassult, de végül minden állat elpusztult. A szövettani vizsgálatok masszív gombás fertőzést mutattak ki a PAF-fal kezelt és a kezeletlen állatok tüdejében is. Mivel az intranasalisan adagolt PAF képtelen volt legyőzni az IPA-t, módosított és kombinált kezeléseket alkalmaztunk. Az IPA-ban szenvedő állatok intraperitonealis kezelése PAF-fal az állatok túlélését csak 1 nappal hosszabbította meg. Hasonló eredményeket kaptunk amfotericin B-vel (AMB), amely szinergisztikusan hat in vitro a PAF-al. A kombinált kezelés AMB-vel és PAF-fal hatékonyabbnak bizonyult, mint akár az AMB vagy PAF kezelés önmagában. Mivel emlősökben eddig nem derült ki a PAF-nak semmilyen toxikus hatása, továbbá nem jelentettek eddig természetes vagy szerzett PAF rezisztenciával rendelkező A. fumigatus törzseket, érdemes lenne további vizsgálatokat végezni a PAF bevezetéséhez potenciális antifungális szerként a humán terápiába.The antifungal protein of Penicillium chrysogenum (PAF) inhibits the growth of important pathogenic filamentous fungi, including members of the Aspergillus family and some dermatophytes. PAF was proven to have no toxic effects on mammalian cells in vitro. To prove that PAF could be safely used in therapy, experiments were carried out to investigate its in vivo effects. Adult mice were inoculated with PAF intranasally in different concentrations, up to 2700 μg/kg daily, for 2 weeks. Mass spectrometry confirmed that a measurable amount of PAF was accumulated in the lungs after the treatment. Lung tissue extracts from PAF treated mice exerted significant antifungal activity. Even at the highest concentration - a concentration highly toxic in vitro for all affected molds used - animals neither died due to the treatment nor were any side effects observed. Histological examinations did not find pathological reactions in the liver, in the kidney, and in the lungs. Small-animal positron emission tomography revealed that neither the application of physiological saline nor that of PAF induced any inflammation while the positive control lipopolysaccharide did. The effect of the drug on the skin was examined in an irritative dermatitis model where the change in the thickness of the ears following PAF application was found to be the same as in control. Since no toxic effects of PAF were found in intranasal application, the next step was to test its efficacy against invasive pulmonary aspergillosis (IPA), experiments were carried out in mice suffering from IPA. Adult mice were immunosuppressed and then infected with Aspergillus fumigatus. After stable infection, the animals were inoculated with PAF intranasally at a concentration of 2,7 mg/kg twice per day. At this concentration -which is highly toxic in vitro to A. fumigatus- the mortality of the animals was slightly delayed but finally all animals died. Histological examinations revealed massive fungal infections in the lungs of both PAF-treated and untreated animal groups. Because intranasally administered PAF was unable to overcome IPA, modified and combined therapies were introduced. The intraperitoneal application of PAF in animals with IPA prolonged the survival of the animals only 1 day. Similar results were obtained with amfotericin B (AMB), with PAF and AMB being equally effective. Combined therapy with AMB and PAF -which are synergistic in vitro- was found to be more effective than either AMB or PAF treatment alone. As no toxic effects of PAF in mammals have been described thus far, and, moreover, there are so far no A. fumigatus strains with reported inherent or acquired PAF resistance, it is worth carrying out further studies to introduce PAF as a potential antifungal drug in human therapy