Evaluation and validation of PCR based diagnostic methods detecting aspergillosis

PhD munkám alapvető célja olyan PCR módszerek fejlesztése volt, amelyek képesek az invazív aszpergillózis azonosítására. Ennek megfelelően nyolc Taqman® real-time esszét (4 Taqman®-MGB és 4 Taqman®-LNA) fejlesztettünk az Aspergillus fumigatus és az Aspergillus terreus fajok detektálására, ill. egy HRM esszét az Aspergillus fumigatus és Aspergillus lentulus fajok azonosítására amplikonjaik olvadáspontjai alapján. Különböző általunk, ill. az ISHAM-EAPCRI központi laboratóriumi munkacsoportja által készített genomi DNS paneleken meghatároztuk esszéink reakció hatékonyságát, szenzitivitását, specificitását, és Aspergillus fumigatus, ill. Aspergillus terreus konídium tartalmú teljes vér paneleken a diagnosztikai hatékonyságukat. Taqman®-LNA3 és Taqman®-LNA4 esszéink rendelkeztek a legalacsonyabb LoD értékekkel, ennek megfelelően dinamikus tartományukat nagyszámú szérum mintán tovább teszteltük. Az ISHAM-EAPCRI laboratóriumi munkacsoport tagjaként saját fejlesztésű diagnosztikai tesztjeinkkel és általunk optimalizált eljárásokkal részt veszünk nemzetközi, körkontrollos vizsgálatokban, ahol a további résztvevőkkel együttműködve validálunk és standardizálunk PCR alapú, aszpergillózis detektáló módszereket, ill. vizsgáljuk, melyek azok a tényezők, amelyek befolyással bírnak diagnosztikai hatékonyságukra. Mérési eredményeink alapján megállapítható, hogy biológiai minták széles skáláján (teljes vér, szérum, BAL) és térfogat tartományában (2,5 ml-200 µl) vagyunk képesek gomba nukleinsavak biológiai mintákból való hatékony kinyerésére (közel 100%) mind manuális, mind pedig automata rendszerben. Továbbá sikeresen optimalizáltunk egy olyan mechanikai lízis protokollt, amely méréseink alapján nukleinsav veszteség nélkül képes az Aspergillus konídiumok biológiai mintákból történő hatékony feltárására. További célunk volt a facC-PCR és az Aspergillus GM-EIA módszerek diagnosztikai erejének a mérése invazív tüdő aszpergillózis detektálására különböző hematológiás megbetegedésben szenvedő, lázas neutropéniás betegek nagyszámú szérum mintáin. A posztmortem hisztológiai eredmények ismeretében elvégeztük a szükséges korrekciót a betegek kategorizálását illetően és ennek megfelelően megmértük a facC-PCR és az Aspergillus GM-EIA módszerek diagnosztikai pontosságát (AUC facC-PCR esetében 0,80, míg a GM-EIA esetében 0,73) és megállapítottuk, hogy a facC-PCR-hez tartozó esélyhányados (DOR facC-PCR 28,67) magasabbnak bizonyult a GM-EIA-hoz tartozónál (DOR GM-EIA 15,33). Prospektív eset-kontroll tanulmányunk során meghatároztuk a konvencionális klinikai módszerek (CT, ill. BAL) diagnosztikai értékét és összehasonlítottuk a kombinált biológiai marker-monitorozáséval (facC-PCR és GM-EIA kombinált analízis). Az egyezés 70,13% volt, amely alapján a kappa statisztika 0,258-nak adódott. Eredményeink alapján igazolást nyert, hogy a konvencionális diagnosztikai módszerek és a PCR-el kombinált biológiai marker monitorozások eredményeinek együttes figyelembe vétele képes lehet korai és hatékony diagnózis felállítására.The primary aim of this study was to develop PCR methods targeting facC orthologous genes for the sensitive detection of invasive aspergillosis in different biological samples. Accordingly we developed eight Taqman® real-time assays (4 Taqman®-MGB and 4 Taqman®-LNA) to specifically detect Aspergillus fumigatus and Aspergillus terreus species and one HRM assay to differentiate among Aspergillus fumigatus and Aspergillus lentulus based on the melting points of their amplicons. We evaluated the PCR amplification efficiency, sensitivity and the specificity of our assays on different genomic DNA panels made in-house and received from the ISHAM-EAPCRI core laboratory working party. We measured the diagnostic utility of our Taqman® real-time assays on biological samples; whole blood and serum spiked with different amount of Aspergillus fumigatus and Aspergillus terreus conidia. Taqman®-LNA3 and Taqman®-LNA4 showed the lowest LoD values on whole blood samples therefore we measured their dinamic range on numerous serum samples. As a member of the ISHAM-EAPCRI laboratory working party we also participated with our in-house PCR platforms in international cross-control studies to identify the most important variables influencing the diagnostic performance of Aspergillus-PCR and collaborate with other members of the laboratory working party to validate a standard for Aspergillus-PCR methodology. Based on the results we can conclude that we were able to develop a very efficient mechanical lysis protocol to disrupt Aspergillus conidia without losing the freely floating nucleic acids from the biological samples and we can extract fungal nucleic acids from biological samples in both automated and manual platform with nearly 100% efficiency. Our secondary aim was to validate the diagnostic power of our facC-PCR method and the gold-standard Aspergillus-GM serology diagnosing invasive pulmonary aspergillosis on large volume serum samples in patients with hematological malignancies and fevered neutropenia. Stratification correction followed by postmortem histology was done and according to this the diagnostic accuracy indexes (AUC for facC-PCR was 0.80 and for GM-EIA was 0.73) and the diagnostic odds ratio of facC-PCR proved to be higher (DOR was 28.67) compared to GM-EIA (DOR was 15.33). We also assessed the diagnostic value of standard clinical methods (CT and BAL) and compared to that of combined biomarker testing (Aspergillus GM-serology and facC-PCR) in our prospective case-control study. The observed agreement was 70.13% generating a kappa statistics of 0.258. With our results we demonstrated evidence that the consideration of standard clinical methods with combined biomarker testing can improve early and more accurate diagnostic decisions.d