Humán plazmacitoid dendritikus sejtek: azonosításuktól a specifikus antivirális funkcióik megismeréséig

A természetes immunitás egy konzervált védelmi mechanizmus, melynek legfontosabb feladatai: 1) a káros, illetve ártalmatlan antigének közötti különbségek felismerése; 2) az immunválasz első védvonalának aktiválása; 3) valamint az adaptív immunrendszer sejtjeinek toborzása, illetve aktiválása. Ezen folyamatok kulcsfontosságú koordinátorai az antigén prezentáló sejtek (APS) hálózatához tartozó dendritikus sejtek (DS). A mieloid DS-ek felfedezését követően, több mint, egy évtizeddel később a kutatók azonosították a DS-ek egy igen kicsi populációját, a plazmacitoid dendritikus sejteket (pDS). Ezen sejtek ritka előfordulása miatt, illetve igen rossz fenntarthatósága végett ex vivo kultúrákban, számos modell rendszert használnak a sejtek tanulmányozására, úgymint a sejtek kevert sejtpopulációkban (pl: PBMC vagy teljes vér) történő vizsgálata, malignus vagy pDS eredetű sejtvonalak alkalmazása. Hasonló nehézséget jelent, hogy specifikus, illetve megfelelő sejtfelszíni antigének hiányában a pDS-ek teljes vérből történő azonosítása igen bonyolult. Munkánk során a két színnel történő azonosítási módszerekhez hasonlóan, kifejlesztettünk a pDS-ek „Blood Dendritic Cell Antigen” 4 (BDCA-4) pozitivitásán alapuló, egyszínű áramlási citometriás módszert, a pDS-ek teljes, perifériás vérből történő azonosítására. Eredményeink igazolták, hogy a BDCA-4 megfelelő és specifikus marker a pDS-ek frissen levett, perifériás vérből történő, egyszínű azonosításához, mivel expressziója nem változik a pDS-ek TLR7 agonistájával, imiquimoddal történő aktiválását követően sem, így a BDCA-4 önmagában elegendő a betegek pDS-einek számában történő változások nyomon követésére. Humán szisztémás lupus erythematosus (SLE) kapcsán kimutatták, hogy szervi érintettség esetében, főként a vesékben történő gyulladásos infiltráció során a pDs-ek száma lecsökken, mivel ezen sejtek a lupuszos léziókba vándorolnak, így szinte teljesen eltűnnek a vérkeringésből. Ezek alapján a pDS-ek számának meghatározása a perifériás vérben kevésbé invazív, ugyanakkor patológiailag releváns markere lehet az SLE-ben szenvedő betegek szöveti érintettségének, illetve státusza megítélésének. A pDS-ek professzionális I-es típusú interferont termelő sejtekként kiemelkedő szerepet játszanak az antivirális immunválaszban, valamint endoszómális Toll-szerű receptoraik (TLR) révén a vírusok felismerésében. Ezen felismerési mechanizmus független a vírusok replikációjától, és hatékonyan érzékeli a nem-replikálódó vírusokat is, szemben más sejtek citoplazmatikus RIG-I szerű helikázaival (RLH), melyek a virális replikáció termékeit képesek felismerni. Több tanulmányban is leírták, hogy a nyugvó pDS-ek kizárólag TLR-eket használnak a vírusok detektálására, ugyanakkor a TLR-ek és RLH-k közötti lehetséges együttműködést eddig még nem vizsgálták. Így munkánk során célul tűztük ki a pDS-ek TLR aktivációt követő RIG-I expressziós változásának, illetve funkcionális sajátosságainak vizsgálatát. Kísérletes eredményeinkkel demonstráltuk, hogy 1) a TLR7 és 9 liganddal aktivált pDS-ekben a RIG-I expresszió fokozódik; 2) a RIG-I expresszió fokózódása független az I-es típusú IFN-ok autokrin hatásától; 3) a TLR7 és TLR9 liganddal történő együttes aktiválás inkább gátló, mint szinergista hatással van a primer pDS-ek RIG-I expressziójának fokozódására. Eredményeink arra utalnak, hogy a TLR-ek és a citoplazmatikus nukleinsav szenzorok a vírusfertőzések során együttműködhetnek. A nem-replikálódó vírus részecskék TLR-ek általi felismerése valószínűleg indukálja a pDS-ek azon felismerési mechanizmusait, melyek által a sejtek képesek lesznek detektálni a citoplazmatikus, vírus replikáció során keletkező virális termékeket. Eredményeink tehát a természetes immunitásban résztvevő felismerő mechanizmusok közötti újfajta kollaborációs szabályozásra hívják fel a figyelmet.Innate immunity is a conserved host defense mechanism and its key functions of are 1) to differentiate between harmful and non-harmful materials; 2) to initiate the first line of immune response; and 3) to recruit and prime the effector cells of the adaptive immune system. Dendritic cells (DCs) are key participants of these processes as part of the network of professional antigen presenting cells. More than a decade after the discovery of myeloid DCs, researchers identified the plasmacytoid DCs (pDCs), a small subset of DCs. Due to the rarity and poor ex vivo culturability of pDCs, various model systems had been considered, including study of pDCs in mixed populations (e.g. PBMC or whole blood) and the use of malignant pDCs or pDC-derived cell lines. Similarly, the lack of specific and suitable cell surface antigens complicated the identification of pDCs in whole blood. In our work, we tested single-color flow cytometric identification of pDCs in whole peripheral blood based on positivity with Blood Dendritic Cell Antigen-4 (BDCA-4) as compared to two-color identification methods. We found that BDCA-4 is a suitable and specific antigen for single-color identification of pDCs in freshly drawn peripheral blood and its expression is not affected by treatment of pDCs with TLR7 agonist imiquimod, suggesting that BDCA4 alone is suitable to monitor changes in pDC counts in patients. It was described that organ involvement, specifically, the inflammatory infiltration of the kidneys correlate well with the decreased pDC counts in human systemic lupus erythematosus (SLE) as these cell migrate to lupus lesions and disappear from the circulation. Therefore, the analysis of pDC counts in peripheral blood offers a minimally invasive yet pathogenically relevant marker of kidney involvement and disease status is SLE. Plasmacytoid DCs have a prominent role in antiviral immunity as professional type I interferon-producing cells, recognizing viruses in their endosomal compartment by Toll-like receptors. In contrast to recognition of viral replication intermediates in the cytoplasm of other cells by RIG-I-like helicase molecules (RLHs), this mechanism does not depend on viral replication and effectively detects non-replicating viruses. Multiple studies suggest that pDCs exclusively employ TLR-mediated viral recognition under steady-state conditions; however, the potential collaboration of TLRs and RLHs was not investigated. Therefore, we aimed to assess the potential expression and function of RIG-I in pDCs following TLR-activation. We could demonstrate that: 1) PDCs up-regulate RIG-I upon treatment with TLR7 and 9 ligands; 2) The up-regulation of RIG-I is independent of type I IFN autocrine feedback regulation; 3) Co-stimulation with a TLR7 and TLR9 ligand showed inhibitory rather than synergistic effect on the up-regulation of RIG-I in primary pDCs. Our results suggest that Toll-like receptors and cytoplasmic nucleic acid sensors might act in co-operation during viral infection. The detection of non-replicating viral particles by endosomal TLRs might sensitize and prepare pDCs for the appearance of viral replication intermediates in the cytoplasm. This concept represents a novel synergy between various innate immune recognition pathways.d