The roles of TASK-3 channels and muscarinic cholinergic receptors in melanoma cells

A közelmúltban megjelent epidemiológiai tanulmányok arra hívják fel a figyelmet, hogy a melanoma malignum incidenciája riasztó mértékben emelkedik. Sajnálatos módon az áttétet adó melanoma malignum különösen rossz prognózisú, mivel a sejtek rezisztensek mind kemoterápiás szerekkel, mind a tumor-specifikus immunválasszal szemben. A jelen munkában a TASK-3 típusú káliumcsatorna és egyes muszkarinos kolinerg receptorok jelentıségét vizsgáltuk sejttenyészetben fenntartott melanoma sejtek túlélésében, valamint intracelluláris Ca2+-homeosztázisuk szabályozásában. A jelenleg elfogadott nézet szerint a TASK-3 csatornák képesek a malignusan transzformált sejtek proliferációjának és/vagy túlélésének fokozására. A hatás hátterében a csatornák által közvetített fokozott hipoxiatolerancia állhat. A TASK-3 csatornák mitokondriális expresszióját sugalló korábbi eredményeinkbıl kiindulva azt tételeztük fel, hogy a TASK-3 csatornáknak szerepe lehet a mitokondriális aktivitás fenntartásában. A jelen munkában azt tanulmányoztuk, hogy a TASK-3 expresszió csökkentésének milyen következményei vannak a WM35 és A2058 típusú melanona sejtek mitokondriális funkciójára és túlélésére. Megállapítottuk, hogy a TASK-3 géncsendesített sejtek mitokondriális membránpotenciálja depolarizáltabb, mint a kontroll sejteké. A géncsendesítés csökkentette a mitokondriális DNS mennyiségét, és redukálta az érintett sejtek válaszkészségét egy szokásos mitokondriális szétkapcsoló ágens alkalmazásának hatására. Mindezen megfigyelések a géncsendesített sejtek károsodott mitokondriális funkcióját jelzik. A TASK-3 expresszió csökkentése a fentiek mellett a sejtek csökkent életképességét, és a sejtekbıl kivonható DNS mennyiségének megkevesbedését is okozta. A géncsendesített sejtek morfológiája ugyancsak megváltozott, és csökkent az érintett sejtek felszíne is. Ellentétben a kontroll melanoma sejttenyészetekkel, amikben nem volt érdemi apoptotikus aktivitás megfigyelhetı, a TASK-3 géncsendesített tenyészetekben az apoptosis irányába elkötelezett sejtek aránya közel 50%-ra emelkedett. A géncsendesített sejtekben megfigyeltük még a citokróm c-nek a mitkondriumokból a citoszólba történı transzlokációját, a kaszpáz-3 enzim aktivitásának fokozódását, és az apoptosis-inducing factor mitokondriumokból sejtmagba történı áthelyezıdését is. Ezen kísérletes adatokból arra következtetünk, hogy a TASK-3 csatorna expressziójának gátlása melanoma sejtekben kaszpázfüggı és -független apoptotikus folyamatokat aktivál. A TASK-3 expresszió csökkenése és az apoptotikus aktivitás fokozódása közötti kapcsolatot valószínőleg a TASK-3 csatorna mennyiségének csökkenése miatti mitokondriális depolarizáció képezi. Eredményeink alapján indokoltnak 78 tartjuk azt a feltételezést, hogy a TASK-3 csatornák sikerrel kecsegtetı célpontjai lehetnek a jövı melanoma-specifikus terápiás módszereinek. A munka második részében olyan kísérleteket végeztünk, amikben különséget kerestünk sejttenyészeti körülmények között fenntartott primer és metasztatikus melanoma malignum sejtvonalak muszkarinos kolinerg receptorokhoz (MR) kapcsolódó intracelluláris Ca2+-jelátvitelében. Elsıként azt erısítettük meg, hogy a vizsgált melanoma sejtek mind az 1- es (MR1), mind a 3-as (MR3) típusú muszkarinos receptorokat expresszálják. Az említett MR-ok funkcióképesek voltak, amit az 1 mmol/l koncentrációban alkalmazott karbamil-kolin (CCh) alkalmazásának hatására megjelenı intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedés jelzett. Megállapítottuk, hogy az MR1- és MR3-specifikus fehérje expressziójának mértéke nem mutatott szignifikáns különséget a metasztatikus (HT199, HT168-M1) és a primer tumor eredető (WM35) sejtvonalakban. Bár CCh alkalmazásával mindhárom sejtvonalban lehetséges volt Ca2+-tranziens kiváltása, a reagáló sejtek aránya a WM35 tenyészet esetében alacsonyabb volt, mint a másik két sejtvonalban. A CCh-által indukált Ca2+-tranziensek kialakulását 0,1 mmol/l atropin alkalmazása hatékonyan meggátolta. A CCh jelenlétében megjelenı Ca2+-tranziensek igen változatos idıbeli lefutást mutattak, és esetenként egy olyan késıi (plató-szerő) komponenst is tartalmaztak, aminek kialakulása az extracellularis térbıl belépı Ca2+-tól függött. Az extracellularis Ca2+-koncentrációt csökkentve a CCh-által kiváltott Ca2+-tranziensek tartama jelentısen csökkent. Ez a jelenség különösen a metasztatikus eredető melanoma sejtek esetében volt kifejezett. Eredményeinkbıl arra következtetünk, hogy nincsenek alapvetı különbségek a primer és metasztatikus eredető melanoma sejtek muszkarinos receptorokhoz kapcsolódó Ca2+-jelátvitelében. A jelen munkában feltárt kvantitatív különbségek ugyanakkor segíthetnek annak megértésében, hogy a metasztatikus melanoma sejtek miért rosszindulatúbbak és miért mutatnak nagyobb migrációs készséget, mint a primer tumorból származó társaik.Recent epidemiology studies indicate that the incidence of melanoma increases at an alarmingly high rate. Unfortunately, metastatic melanoma has particularly poor prognosis because it is resistant to both chemotherapy and antitumour immune response. In the present work we have studied the significance of the TASK-3 potassium channels and muscarinic cholinergic receptors in the survival and intracellular Ca2+ homeostasis of cultured melanoma cells. TASK-3 channels are thought to promote proliferation and/or survival of malignantly transformed cells, most likely by increasing their hypoxia tolerance. Based on our previous results that suggested mitochondrial expression of TASK-3 channels, we hypothesized that TASK-3 channels have roles in maintaining mitochondrial activity. In the present work we have studied the effects of reduced TASK-3 expression on the mitochondrial function and survival of WM35 and A2058 melanoma cells. TASK-3 knockdown cells had depolarized mitochondrial membrane potential and contained a reduced amount of mitochondrial DNA. Compared to their scrambled shRNA-transfected counterparts, they demonstrated diminished responsiveness to the application of an established mitochondrial uncoupler. These observations indicate impaired mitochondrial function. Further, TASK-3 knockdown cells presented reduced viability, decreased total DNA content, altered cell morphology, and reduced surface area. As opposed to control melanoma cell lines, which did not present noteworthy apoptotic activity, the rate of apoptosis was about 50% in the TASK-3 knockdown cultures. Sequestration of cytochrome c from the mitochondria to the cytosol, increased caspase 3 activity, and translocation of the apoptosis-inducing factor from mitochondria to cell nuclei were also demonstrated in TASK-3 knockdown cells. We conclude that interference with TASK-3 channel expression induces caspase-dependent and caspase-independent apoptosis of melanoma cells, most likely via causing mitochondrial depolarization. Based on our results we submit that TASK-3 channels may be legitimate targets of future melanoma therapies. In the second part of the work, experiments were carried out to describe differences between cultured primary and metastatic melanoma cell lines in their muscarinic acetylcholine receptor- (MR-) mediated intracellular Ca2+ signalization. We confirmed the expression of type 1 and type 3 MRs (MR1, MR3). The functionality of these MRs was tested by applying 80 1 mM carbamyl-choline (CCh) and recording the associated increases of the cytoplasmic [Ca2+]. We found that the expression levels of the receptor proteins were not significantly different in the metastatic (HT199, HT168-M1) and the primary (WM35) cell lines. Although CCh application induced Ca2+ transients in all three investigated cell lines, the proportion of responding cells was the smallest in the WM35 cell culture. The CCh-induced Ca2+ transients could be effectively blocked by atropine (0.1 mM). The time courses of the Ca2+ transients were highly variable, and in some instances they showed a late (plateau-like) component, whose presence crucially depended on the influx of extracellular Ca2+. When the extracellular Ca2+ concentration was reduced, the duration of the CCh-evoked transients was considerably decreased. This phenomenon was more pronounced in the metastatic cell lines. We conclude that although there are no fundamental differences in the MR-mediated Ca2+ signalization of the primary and metastatic cell lines, the quantitative differences revealed in the present work may help to understand why metastatic cells have increased malignancy and more pronounced migratory potential than those isolated from a primary tumour.N