A ras jelátviteli útvonalait befolyásoló fehérjék szerepének vizsgálata daganatok kialakulásában

The aim of our experiments was to investigate the potential function of RasGRP3 and nPKCδ in the formation and progression of human breast cancer and rhabdomyosarcoma. First, the RasGRP3 expression was examined in human invasive ductal adenocarcinoma derived samples and cell lines (BT-474, JIMT-1, MCF7, SK-BR-3, MDA-MB-453, T-47D) both in mRNA (Q-PCR) and protein (Western blot; immunohisto- and immunocytochemistry) levels. According to our results RasGRP3 expression was elevated in human breast tumor tissue samples. To explore the biological function of the proteins, RasGRP3 knockdown and nPKCδ overexpressor cultures were established. Down-regulation of RasGRP3 expression in breast cancer cells decreased cell proliferation, induced apoptosis in MCF7 cells, and sensitized T-47D cells to the action of drugs Tamoxifen and trastuzumab (Herceptin). Gene silencing of RasGRP3 reduced tumor formation in mouse xenografts as well. Inhibition of RasGRP3 expression also reduced Akt, ERK 1/2 and estrogen receptor alpha phosphorylation downstream from insulin like growth factor-I (IGF-I) or epidermal growth factor (EGF) stimulation. Recombinant overexpression of nPKC in rhabdomyosarcoma (RD) cells increased proliferation. Conversely, overexpression of kinase-negative mutant of nPKCδ (DN-nPKCδ) markedly inhibited cell growth. Moreover, overexpression of nPKCδ also stimulated in vivo tumor growth and induced malignant transformation in immunodeficient (SCID) mice whereas that of DN-nPKCδ suppressed tumor formation. Taken together, our results suggest that RasGRP3 and nPKCδ may have a role in the pathological behavior of breast cancer and rhabdomyosarcoma cells and may constitute a therapeutic target for these cancers. A RasGRP3 és nPKCδ, a Ras-kapcsolt jelátviteli útvonalak aktivitását befolyásolni képes fehérjék. Mindkét fehérje potenciális onkogén hatású molekula; már több rosszindulatú daganattípusban is leírták a génjének amplifikációját és a fehérjetermék overexpresszióját. A fehérjék potenciális onkogén hatását figyelembe véve kísérleteink során egyrészt megvizsgáltuk a RasGRP3 kifejeződését és funkcionális szerepét az egyik legrosszindulatúbb daganattípusban, az emlő eredetű ductalis adenocarcinomában, továbbá az nPKCδ izoforma szerepét rhabdomyosarcoma sejtek in vitro és in vivo növekedésének szabályozásában. Kísérleteink során sikerrel igazoltuk a RasGRP3 gén- és fehérjeszintű jelenlétét humán, emlő eredetű ductalis adenocarcinomából származó humán szöveti mintákon. Megállapítottuk, hogy míg a RasGRP3 jellemzően a sejtek citoplazmájában expresszálódik, addig az aktív foszforilált forma nukleáris/perinukleáris elhelyezkedést mutat. Ezt követően primer és metasztatikus emlő tumoros sejtvonalakon is kimutatnunk a fehérje expresszióját. A RasGRP3 és nPKCδ funkcionális szerepét tisztázandó RasGRP3 géncsendesített emlő tumoros és nPKCδ overexpresszált rhabdomyosarcoma tenyészeteket hoztunk létre. A RasGRP3 expresszió gátlásának segítségével megállapíthattuk, hogy a fehérje expressziójának gátlása a sejtek proliferációját in vitro és in vivo szignifikánsan csökkenti, valamint apoptotikus folyamatokat indukál az MCF7 sejvonalban. Továbbá kimutattuk, hogy a géncsendesítés következtében a T-47D sejtek rezisztenciája a kemoterápia során használt Tamoxifennel és Herceptinnel szemben csökken. Jelátviteli kísérleteink során megállapítottuk, hogy a fehérje gátlásával a Ras kapcsolt jelátviteli útvonalak aktivitása jelentős mértékben csökkenthető. Az nPKCδ overexpresszióját követően az RD sejtekben, MTT assay segítségével sikeresen kimutattuk, hogy ez az izoforma fokozza a sejtek in vitro és in vivo proliferációját SCID egerekbe injáktalva. Jelátviteli kísérleteink során igazoltuk, hogy a nPKCδ izoforma a MAPK útvonal „upstream” regulátoraként viselkedik rhabdomyosarcomában; a fehérje overexpressziójával az ERK ½ kináz aktivitása szignifikánsan fokozódik. Eredményeink alapján feltételezhető, hogy mindkét fehérje potenciális onkogén szereppel bír az említett tumorok kialakításában és a sejtek növekedésének szabályozásában.N