Analysis of the ß-lactamases of Borderline Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus Strains

A Staphylococcus aureus az egyik legjelentősebb patogén baktérium, ezért a törzsek antibiotikum-rezisztenciájának vizsgálata nagy fontossággal bír. Massidda és munkatársai leírtak egy olyan enzimet borderline methicillin-rezisztens S. aureus-ban (BORSA), mely képes volt bontani az oxacillint. Ez a 31 kDa-os enzim methicillin indukció hatására jelent meg a membránfrakcióban, és nem lehetett átvinni Escherichia coli-ba a BlaZ penicillináz génjét hordozó plazmid transzformálásával. A célunk az volt, hogy ezt az oxacillinázt azonosítsuk. Különböző forrásból származó S. aureus-ok közül oxacillin MIC értékek alapján kiválasztottuk a BORSA törzseket, összesen 7 humán és 4 bovin izolátumot. A 4 bovin és 6 humán izolátum mecA negatív volt, de a 822-es törzs hordozta a mecA-t, esetében a PBP2a nem működhetett megfelelően. Irodalmi adatok szerint a BORSA törzsek mind az V. fágtípusba tartoznak, és csak az ilyen fágokkal tipizálható MSSA (methicillin-érzékeny S. aureus) törzsek váltak borderline rezisztenssé, és mutattak oxacillin-bontó képességet a blaZ-t hordozó plazmid transzformálása után. Törzseink esetében az összes humán és három bovin izolátum tipizálódott az V. fágcsoport fágjaival, kivéve a nem tipizálható 822-es törzset. Ezek közül a bovin izolátumok közül kettő nem volt tipizálható a bovin fágokkal, valószínűleg emberről kerültek át szarvasmarhára. Biológiai titrálással megállapítottuk a törzsek oxacillin-bontó aktivitását, ami 10-3 – 10-4 μmol/mg teljes fehérje/perc közé esett, leggyengébben az V. fágcsoportbeli fágokkal nem tipizálódó bovine törzs teljesített. Minden törzs indukció nélkül is termelt enzimet, melynek mennyisége növelhető volt methicillin jelenlétében való tenyésztéssel. Az extracelluláris és a membránkötött fehérjék 1-D majd 2-D SDS-poliakrilamid gél elektroforézise során a gélben ß-laktamáz aktivitást detektáltunk. A 30 kDa-os és a 14 kDa-os molekulatömeg-tartományban mutattunk ki enzimaktivitást, és a fehérjéket tömegspektometriai analízisnek vetettük alá. A 14 kDa-os tartományban detektált fehérje a sejtek feltárására használt lizozim volt. Spektrofotométerrel meg is tudtuk határozni nitrocefin és cefaloridin bontó aktivitását. A 30 kDa-os tartományban általában több fehérje volt jelen a 2-D géleken, savas (pI 4-5) illetve bázikus (pI 9-10) pH tartományban, melyeket BlaZ-ként azonosítottunk. A két szarvasmarhára adaptálódott törzs esetében szintén a BlaZ volt a ß-laktamáz aktivitás fő forrása, de a referencia szekvenciától egy kb. 7%-ban eltérő variáns. Mivel a fragmentek között olyanokat is találtunk, melyek a referencia szekvenciára illeszkedtek, és az adatbázisban fellelhető variánsra nem, ezért feltételezzük, hogy a törzsek ß-laktamázának szekvenciája még nem szerepel az NCBI adatbázisban. Mivel a Dr. Massidda által rendelkezésünkre bocsátott két BORSA törzsben is csak a BlaZ-t tudtuk azonosítani, ezért a végkövetkeztetésünk az, hogy ezek a törzsek nem egy új oxacillináz enzimmel rendelkeznek, hanem a BlaZ penicillináz rendelkezik megnövekedett oxacillináz aktivitással. Feltételezzük, hogy ezt valamilyen poszttranszlációs módosítás (vagy éppen egy módosítás elmaradása – eltávolítása) okozhatja, mely magyarázhatja az eltérő pI és kissé eltérő molekulatömeg értékeket is. Staphylococcus aureus is one of the most important pathogenic bacterium, so the investigations of the antibiotic-resistance of the strains have crucial importance. Massidda and co-workers described an enzyme in borderline methicillin-resistant S. aureus (BORSA), which was also able to hidrolyse oxacillin. This 31-kDa enzyme was found in the membrane fraction after methicillin induction and it could not be transformed to Escherichia coli using the plasmid carrying the gene of BlaZ penicillinase. The aim of our study was to identify this enzyme. We have selected BORSA strains (altogether 7 human and 4 bovine isolates) from different sources according to their oxacillin MIC values. All 4 bovine and 6 of the human isolates were mecA negative but strain 822 carried mecA. In this latter case the encoded enzyme must have been defective. According to the published data all of the BORSA strains belong to phage type V. and only MSSA (methicillin-sensetive S. aureus) strains typable with group V. phages became borderline resistant and showed oxacillin-hydrolysing ability after the transformation of a blaZ bearing plasmid. We have found that all the human isolates except 822 were typable with group V. phages. Three of the bovine isolates were also typable with group V. phages, but interestingly two of these strains were not typable with the bovine phages, so they might had been transferred from human to cow. The exact oxacillinase activity of the strains was also determined. Oxacillin was hydrolysed at a 10-3 – 10-4 μmol/mg total protein/minute activity. The slowest hydrolyser was the bovine strain, which was not typable with group V. phages. All the strains produced ß-lactamase constitutively and the rate of enzyme production could be increased by culturing the strains in the presence of methicillin. Extracellular and membrane-bound proteins were separated by 1-D and then by 2-D SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and the in situ ß-lactamase activity was detected. We have detected ß-lactamases at the 30 kDa and 14 kDa molecular weight range and the proteins were analysed by mass spectrometry. The protein detected at 14-kDa was identified as lysozyme, which was used in our experiment to hydrolyse bacterial cell wall. Its nitrocephin and cephaloridin hydrolysing ability could be determined by spectrophotometric method. 30-kDa proteins with ß-lactamase activity were detected both in acidic (pI 4 – 5) and basic (pI 9 – 10) pH ranges. These proteins were identical to the BlaZ. In the case of the two bovine specific strains BlaZ was the main source of the ß-lactamase activity, too, however, the identified enzyme was a variant of BlaZ, differing approximately in 7% of its amino acids compared to that of the reference sequence. Since some such fragments were found, which could be fitted to the reference sequence, but not to the identified variant, it was concluded that the sequences of the ß-lactamases present in the two bovine specific strains have not been deposited to the NCBI database yet. Since in the two BORSA strains, kindly provided by Dr. Massidda we detected only BlaZ enzyme, our final conclusion is that these strains do not harbour a new oxacillinase enzyme, but their penicillinases showed elevated oxacillinase activity. The elevated oxacillinase activity could be the consequence of some posttranslational modifications (or the lack of it), which could explain the differences in the pIs and in the molecular weights of the identified ß-lactamase enzymes.d