Új lehetőségek a valós idejű PCR alkalmazására a molekuláris diagnosztikában

Kísérleteink célja az volt, hogy megvizsgáljuk a közelmúltban bemutatkozott génszkenneléses eljárás alkalmazhatóságát a laboratóriumunkba érkező klinikai beteg anyagokon, illetve vizsgálataink tárgyát képezte az is, hogy a módszer alkalmas-e a minták előszűrésére és ezáltal a diagnosztikus labor költséghatékonyabbá tételére. Kísérleteink másik célja az volt, hogy a várhatóan a következő években gyakorlati alkalmazásra kerülő EGFRvIII fehérjét célzó vakcinához molekuláris diagnosztikát fejlesszünk, mely alkalmazható lenne a jelenleg forgalomban lévő monoklonális antitest terápia kiegészítő diagnosztikájaként is. Kísérleteink az alábbi lépésekből álltak: 1. A klinikai partnerintézményekből kapott, sebészileg eltávolított és formalin-fixált paraffinba ágyazott mintákból DNS-t, illetve RNS-t izoláltunk. A kinyert nukleinsavak koncentrációit valamint tisztaságát az 1. és a 3. táblázat tartalmazza. 2. A kivont DNS-ből több lépcsős nested PCR-rel amplifikáltuk fel a K-Ras gén 2. exonját, melyet utána Sanger-szekvenálással vizsgáltunk, mutációk után kutatva. 3. A kivont DNS-ből real-time PCR-rel is megvizsgáltuk a K-Ras gén 2. exonját, az amplifikáció után a termék megolvasztásával génszkennelést végeztünk, szintén mutációkat keresve. A két módszerrel nyert eredményeket és azok összehasonlítását a 2. táblázat tartalmazza. 4. Vizsgálataink eredményeként elmondhatjuk, hogy a génszkennelés alkalmas módszer a minták előszűrésére, kellő pontossággal és megbízhatósággal mutatja ki a vad illetve mutáns allél jelenlétét a mintában, alkalmazásával a K-Ras gén 2. exonjának mutációanalízisén alapuló molekuláris diagnosztika jelentősen felgyorsítható és költséghatékonyabbá tehető. 5. A kivont RNS-ből többféle módon is szintetizáltunk cDNS-.t: gén specifikus primerpár, oligodT, random hexamer primerkeverékkel, illetve ezek különböző arányú kombinációjával. A háztartási kontrollgéneket minden esetben ki tudtuk mutatni, az EGFRvIII mutáns gén azonban csak gén specifikus primerpár felhasználásával volt detektálható. 6. Az irodalomban is elfogadott arányban sikeresen mutattuk ki a különösen malignus EGFRvIII mutációt a vizsgált klinikai mintákból, egy újonnan fejlesztett real-time PCR alapú diagnosztikus módszerrel.MscBiológusg