Electrophysiological Studies of Voltage-gated Ion Channels

Munkánk során sejtmembránbeli feszültség-aktivált kationcsatornák tulajdonságait vizsgáltuk. 1. Különböző zsírsavaknak a KV1.3 csatornák kinetikájára kifejtett hatását tanulmányoztuk PHA és IL-2 stimulált HPL-kon. Eredményeink szerint a kifejtett hatás összefüggésben van az adott zsírsav telítetlenségének mértékével és/vagy lánchosszával. Minden vizsgált PUFA befolyásolta a limfociták KV1.3 csatornáinak aktivációs és inaktivációs kinetikáját – gyorsítva a kérdéses időállandókat –, ellentétben a vizsgált MUFA-val és SFA-kkal. Ugyanakkor a kísérleteinkben vizsgált összes zsírsav változatlanul hagyta az egyensúlyi paramétereket, vagyis az aktiváció és az inaktiváció feszültségtől való függését. A zsírsavak limfocitamembránba történő beépülésének igazolására végzett gázkromatográfiás mérések mutatják az egyes kezelések eredményességét: minden vizsgált zsírsav nagyobb mennyiségben jelent meg a limfociták plazmamembránjában, mint amennyi a kezeletlen sejtekben található volt. Kimutattuk tehát, hogy a PUFA-k képesek módosítani a KV1.3 csatornák kinetikáját HPL-kon azáltal, hogy megváltoztatják a mikrokörnyezetet a lipid kettős rétegben. Ily módon a PUFA-kban gazdag étrend fontos lehet a megfelelő lipidösszetétel fenntartásához vagy lipidkorrekció indukálásához. A T sejt-aktiváció a feszültség-kapuzott és a Ca2+ aktivált K+ csatornák és a Ca2+ felszabadulás-aktivált Ca2+ csatornák működésén alapul, a T limfocitákban a kifejeződő KV1.3 csatornák irányítják a membránpotenciált és a jelátvitelt. Ezért a KV1.3 csatornák működésének PUFA indukált megváltozásai előidézhetik az immunrendszer funkciójának megváltozását. Ezek a PUFA indukált hatások hasznosak lehetnek az immunrendszer működési zavarainak és/vagy akut és krónikus gyulladásoknak a kezelésében. 2. Kimutattuk, hogy a K+ áramok mértéke és az adenozinreceptor-stimuláció vagy -inhibíció között kapcsolat van a DDT1 MF-2 sejtek esetében. Jelen értekezést előzetes méréseinkkel is összevetve – melyekről Rubovszky Bálint értekezésében már beszámolt [265] – megállapíthatjuk, hogy az alkalmazott adenozin-agonisták és -antagonisták részt vesznek az adenozinreceptor-mediált folyamatban, és igazolják az A1 és A2 adenozin-receptorok jelenlétét és aktivitását a vizsgált sejtvonalon. A K+ áram tulajdonságaiban bekövetkezett változások során a receptorok a csatornákra G protein-független módon fejtik ki hatásukat. Ugyanakkor a vizsgált P1 agonisták és antagonisták a sejteken levő Na+ csatornák konduktanciáját nem befolyásolták. A DDT1 MF-2 sejtek egyedülállóak abban a tekintetben, hogy képesek válaszolni mind az A1 receptor-aktivációra K+ konduktancia-növekedéssel és hiperpolarizációval, mind az A2 receptor-aktivációra K+ áram-csökkenéssel és depolarizációval. Így lehetőség nyílik ezen sejtek farmakológiai felhasználására: az A1 és A2 receptor-mediált mechanizmusok ugyanazon sejtvonalon történő tanulmányozására. ----- Characteristics of voltage-gated cation channels in the cell membrane were studied in this thesis. 1. We examined the effect of certain fatty acids (FAs) on the kinetics of KV1.3 channel gating of PHA- and IL-2-stimulated human peripheral lymphocytes (HPLs). Our study indicated that the effect carried out by FAs depended on the degree of unsaturation and/or the chain length of the FAs. All of the studied polyunsaturated FAs (PUFAs) [linoleic acid (LA), arachidonic acid (AA) and docosahexaenoic acid (DHA)] influenced the activation and inactivation kinetics of the KV1.3 channels of HPLs (decreased the time constants mentioned above), whereas the monounsaturated FA (MUFA) oleic acid (OA) and the saturated FAs (SFAs) [palmitic acid (PA) and stearic acid (SA)] were ineffective. This pattern parallels the efficacy of FAs to interfere with lymphocyte activation processes. However, these FAs did not affect the voltage-dependence of steady-state activation and steady-state inactivation of the channels. The efficacy of the incorporation of FAs into the HPL membrane was confirmed by gas chromatographic measurements, each treatment specifically increased the relative contribution of the corresponding FA to the total amount of FAs in plasma membrane of HPLs. We have demonstrated here that enrichment of the membrane with various PUFAs can modulate the kinetics of KV1.3 channels in HPLs probably via alteration of microenvironment in the lipid bilayer. In this way, a diet rich in PUFAs can be important in maintaining the suitable lipid composition of the membrane for proper operation of these channels or induction of lipid correction. T-cell activation is based on the operation of the voltage-gated K+ channels, the Ca2+ activated K+ channels and the Ca2+ release activated Ca2+ channels, and KV1.3 channels expressed in T-lymphocytes control the membrane potential and signal transduction. Therefore the PUFA-induced modification of KV1.3 kinetics might have important consequences regarding the inhibition of the activation of T-cells under pathophysiological conditions. This might contribute to the beneficial effects of dietary PUFA supplement in autoimmune reactions and/or during chronic inflammation. 2. We have revealed a relationship between the order of K+ currents and adenosine receptor stimulation or inhibition in DDT1 MF-2 smooth muscle cells. On the basis of both this present study and our earlier measurements presented by Bálint Rubovszky in his Ph.D. thesis [265], we can conclude that applied adenosine agonists (NECA, F-NECA, CPA, CGS 21680) and antagonist (ZM 241385) take part in the adenosine mediated process and verify the presence of A1 and A2 adenosine receptors in the studied cell line. During the changes in the properties of K+ current, receptors act on the channels in a G protein indepentent way. On the other hand, the examined P1 agonists and antagonist did not influence the conductance of Na+ channels in this smooth muscle cells. DDT1 MF-2 cells have proved to be unique to response to both the A1 receptor activation with increase in K+ conductance and hyperpolarization, and the A2 receptor activation with decreased K+ current and depolarization. In this way, these cells can be useful targets of pharmacological research, because they provide the possibility of tracking A1 and A2 receptor mediated mechanisms on the same cell line