Genetic and Gene Expression Alterations During the Melanoma Progression

A dolgozatban szereplő vizsgálatok fő célja a humán melanoma progressziójában szerepet játszó genetikai és génexpressziós eltérések tanulmányozása, az eltérések klinikopatológiai paraméterekkel történő korrelációs analízise volt. 1. Primer melanomák klinikopatológiai paramétereivel összefüggő génexpressziós eltéréseket vizsgálva, szignifikáns mértékű expressziós változást mutattunk ki a daganatok felszínének kifekélyesedésével (ulceráció) és a melanomák metasztatázisképző tulajdonságával. • Ulcerációval öszefügő mRNS szint változást 1095 génnél figyeltünk meg, gének többsége az ulcerált felszínű melanomákban csökkent expresszióval társult. Ugyanezen gének megnövekedett expressziós szintjét detektáltuk a nem kifekélyesedő felszínű melanoma mintákban. • A rossz prognózisú melanomákban a legmagasabb expressziós átlagértéket az osteopontin génre mutattunk ki. A jobb prognózisú daganatokban legnagyobb mértékben a defenzin szintje emelkedett meg, mind az OPN mind a defenzin az Nf-B transzkripciós faktor indukcióját okozza. • Az ulcerált felszínű melanomákban csökkent expressziójú gének funkcióját vizsgálva kimutattuk, hogy többségük a bőr- és szőrfejlődési funkció, dermatológiai betegségek, daganatfejlődés, sejtosztódás a sejtciklus, sejt-sejt interakció és sejtmotilitás szabályozó folyamatokhoz tartozik, a p53, ERK/MAP, IP3/AKT és WNT/ katenin, Nf-B molekulási útvonalakon hatva. • Array CGH és génexpressziós adatainkat összehasonlítva, a génexpressziós szint csökkenés hátterében a vizsgált géneknél megállapítottok, hogy nem az adott kromoszómális szakasz deléciója áll. 2. Hiearchikus klaszter analízissel kimutattuk, hogy a nyirokcsomó metasztázisok génexpressziós mintázata rossz prognózissal jellemezhető primer melanomák génexpressziós profiljához hasonló. 3. Saját adatainkat összehasonlítva irodalmi génexpressziós eredményekkel, 212 melanoma progresszióval összefüggő génexpressziós változást mutató közös gént azonosítottunk. 4. Interfázisos FISH analízissel kimutattuk, hogy az EGFR génkópiaszám többlete, primer melanomákban rossz prognózissal társul. • Deléció és kismértékű amplifikáció szignifikánsan nagyobb mértékben fordult elő férfi betegekből származó melanomákban. • Az EGFR gén kópiaszáma szignifikánsan magasabb a 4,01 mm-nél vastagabb Breslow vastagságú daganatokban. • A követési időn belül metasztázist képző léziókra a gén kis- és nagymértékű amplifikációja egyaránt jellemző elváltozás. A tumorsejtekben kimutatott EGFR extra kópia a betegek rövidebb túlélésével társul. • Hasonlóan szignifikáns asszociációt mutattunk ki a daganatok felszíni kifekélyesedése valamint az EGFR gén többlet között. 5. A gén amplifikációs státusza és az EGFR mRNS valamint a fehérje expresszió mértéke között nem volt lineáris korreláció. • A léziókban az EGFR fehérje kismértékű expresszióját vagy annak teljes hiányát figyeltük meg függetlenül a minták EGFR gén kópiaszámától és az mRNS expresszió szintjétől. 6. A 19-es exon aktivációs mutációt, ami más daganatok jellegzetes alterációja, egyetlen melanoma mintában sem detektáltuk. 7. FISH vizsgálataink során kimutattuk, hogy a 9p21 vesztés gyakori eltérés sporadikus primer melanomákban. • A 9p21-es lokusz delécióját mind a korai, mind a késői melanomákban megfigyeltük. • A 9p21 deléciója mellett a lokusz kópiaszám többletét is kimutattuk. • Nem találtunk szoros korrelációt a 9p21-es lokusz genetikai eltérései és a daganatok klinikopatológiai tulajdonságai között. ----- Our main purpose was to investigate the genetic and gene expression changes during the melanoma progression, and to correlate the alteration to the clinicopathological parameters of tumors. 1. Correlation of gene expression changes of primary melanomas and clinicopathological variables of lesions, significant association was only present related to the ulceration and metastases formation of tumors. • The Volcano plot analysis identified 1095 significantly differentially expressed genes are associated with ulceration. Major part of differentially expressed genes (1021) was found to be down regulated in ulcerated melanomas versus less aggressive group, whereas these genes were upregulated in melanomas without ulcerated surface • Osteopontin (OPN) was the most highly expressed genes in aggressive melanomas. The defensin-, was the most highly up-regulated genes in less aggressive melanomas. Both genes activate the Nf-B transcription factor. • This gene signature is comprised of critical mediators of hair and skin development and function, organ development, dermatological diseases and conditions cellular development, cellular growth and proliferation, cardiovascular system development and function cell morphology, cellular assembly and organization, cell-to-cell signaling and interaction. We also demonstrated that these genes are mainly involved in the p53, ERK/MAP, Nf-kB, WNT/ -catenin pathways. • Comparing the results of aCGH and microarray, there was no correlation between decreased gene expression and genome alterations in the melanomas 2. Gene expression pattern of lymphnode metastases was found to be more similar to that of the more-aggressive melanomas than the less-aggressive melanomas. 3. We found that elevated copy number of EGFR gene is associated with poor prognosis in primary melanomas. amplified • Deletion and low level amplification was significantly higher in tumors removed from male patients compared to female patients. • The average number of EGFR gene copies was significantly higher in tumors that were thicker than 4.00 mm compared to the thinner tumors. • The EGFR gene copy number index in tumors that formed metastasis within 5 years after the diagnosis of the primary lesion was significantly higher. Outcome of patients whose primary tumors had highly amplified or extra copies of the EGFR gene was poor. • Significant correlation was also detected between the ulceration of the tumor surface and the elevated EGFR gene copies. 4. The correlation between the gene amplification status and the level of mRNA and protein expression was not linear. • Samples exhibited weak or lack of EGFR protein expression without strong correlation between EGFR gene copy number alterations and the level of EGFR protein expression. 5. No mutation was seen in any of the analyzed samples within tyrosine kinase domain in exon 19 of the EGFR gene. 6. Our FISH results demonstrate that, the loss of 9p21 is a frequent alteration in primary melanomas. • 9p21 deletion is present in early and late stages of the disease at similar frequency. • Beside on chromosome 9 and 9p21 losses we also detected copy number gain of CEP 9 and 9p21. • Comparing the 9p21 status of melanomas and the patients’ clinical parameters we could not find strong correlation