Magnetolipossomas baseados em nanopartículas de níquel/sílica e ferrites como nanotransportadores de potenciais fármacos antitumorais

Tese de Doutoramento - Programa Doutoral em Física (MAP-fis)Cancer is one of the diseases with higher incidence among the world population nowadays, with a huge mortality rate. Most of antitumor drugs used in chemotherapy are toxic and cause systemic side effects. In biomedicine, the potential of magnetic nanoparticles has been increasingly recognized, due to their unique size and physicochemical properties. Nanoparticles with superparamagnetic behavior are preferred for these purposes, as they exhibit a strong magnetization only when an external magnetic field is applied. The development of liposomes entrapping magnetic nanoparticles, the so-called magnetoliposomes, allows a safer use of powerful anticancer drugs in chemotherapy as they can overcome many pharmacokinetics problems and systemic toxicity. Furthermore, magnetoliposomes can be guided and localized to the therapeutic site of interest by external magnetic field gradients and used in cancer treatment by hyperthermia. In this work, nickel/silica core/shell and several ferrite nanoparticles were synthesized. Magnetic nanoparticles with nickel core and silica shell were prepared by soft chemical methods, using tetraethyl orthosilicate (TEOS) and different surfactants as templating media. Nickel nanoparticles without silica shell showed sizes of 66 ± 24 nm, while the ones with silica shell are larger and more polydisperse. Magnetic nickel nanoparticles and several ferrite nanoparticles, namely of nickel ferrite (NiFe2O4), manganese ferrite (MnFe2O4) and magnetite (Fe3O4) were obtained by coprecipitation method. All these nanoparticles show a crystalline structure and generally small diameters, exhibiting size distributions of 11 ± 5 nm for nickel ferrite, 26 ± 7 nm for manganese ferrite and 11.6 ± 1.6 nm for magnetite nanoparticles. The magnetic properties indicate a superparamagnetic behavior at room temperature for all types of ferrite particles, with magnetic squareness values (Mr/Ms) below 0.1. However, nickel nanoparticles showed a ferromagnetic behavior. Magnetite nanoparticles revealed to be the ones with higher saturation magnetization of 62 emu/g, while manganese ferrite and nickel ferrite nanoparticles exhibited values of 36 emu/g and 23.54 emu/g, respectively. All the prepared nanoparticles were incorporated in liposomes by different procedures, thereby producing distinct magnetoliposomes. Either the magnetic nanoparticles were entrapped in liposomes, originating aqueous magnetoliposomes (AMLs), or covered with a lipid bilayer, forming solid magnetic liposomes (SMLs). A new and promising route for the synthesis of SMLs was developed and the coverage of the nanoparticles with a lipid bilayer was proven by FRET (Förster Resonance Energy Transfer) measurements, using fluorescent-labelled lipids (with the fluorophores NBD and Rhodamine). Both AMLs and SMLs revealed to be suitable for biomedical applications, possessing sizes below 150 nm and a narrow size distribution. Both AMLs and SMLs based on manganese ferrite nanoparticles showed superparamagnetic behavior at room temperature, the SMLs exhibiting a high saturation magnetization of 34.16 emu/g, similar to the observed for net manganese ferrite nanoparticles. Membrane fusion between both types of magnetoliposomes (AMLs and SMLs) and GUVs (Giant Unilamellar Vesicles, used as models of cell membranes) was confirmed by FRET assays, showing the potential of these bionanosystems to release drugs by fusion with cell membranes. New potential antitumor drugs, thienopyridine derivatives with proven antitumor activity, were successfully incorporated into both aqueous and solid magnetoliposomes, with high encapsulation efficiencies (> 75%). Moreover, in vitro assays in several human tumor cell lines, namely HeLa (cervical carcinoma), MCF-7 (breast adenocarcinoma), T3M4 (pancreatic cancer), HCT15 (colon adenocarcinoma) and NCI-H460 (non-small cell lung carcinoma) revealed that AMLs based on MnFe2O4 nanoparticles are able to release the encapsulated compounds and to inhibit the growth of human tumor cells. Overall, these results point to a promising application of these systems in oncological therapy, simultaneously as nanocarriers for antitumor drugs and hyperthermia agents.O cancro é uma das doenças com maior incidência na população mundial na atualidade, com uma taxa de mortalidade enorme. Uma grande parte dos fármacos usados em quimioterapia são tóxicos e causam efeitos secundários. Na área da Biomedicina, o potencial das nanopartículas magnéticas tem sido cada vez mais reconhecido, devido ao seu tamanho reduzido e às suas propriedades físico-químicas únicas. Para aplicações biomédicas, estas nanopartículas devem apresentar um comportamento superparamagnético à temperatura ambiente, uma vez que exibem elevada magnetização apenas na presença de um campo magnético externo. O desenvolvimento de lipossomas contendo nanopartículas magnéticas (magnetolipossomas) permite uma utilização mais segura de fármacos antitumorais potentes na quimioterapia, uma vez que estes nanossistemas podem superar muitos dos problemas de farmacocinética e de toxicidade sistémica. Além disso, os magnetolipossomas podem ser guiados e localizados no local terapêutico de interesse através de gradientes de campo magnético externo e ainda ser utilizados no tratamento do cancro por hipertermia magnética. Neste trabalho, foram sintetizadas nanopartículas núcleo/coroa de níquel/sílica e várias ferrites. Assim, foram preparadas nanopartículas magnéticas com núcleo de níquel e coroa de sílica por métodos químicos suaves, usando tetraetilortossilicato (TEOS) e diferentes agentes surfactantes como moldes. As nanopartículas de níquel sem coroa de sílica mostraram tamanhos de 66 ± 24 nm, enquanto as que possuem cobertura de sílica são maiores e mais polidispersas. Nanopartículas magnéticas de níquel e vários tipos de ferrites, nomeadamente ferrite de níquel (NiFe2O4), ferrite de manganês (MnFe2O4) e magnetite (Fe3O4), foram obtidas pelo método de coprecipitação. Todas estas nanopartículas possuem uma estrutura cristalina e diâmetros geralmente pequenos, exibindo uma distribuição de tamanhos de 11 ± 5 nm para a ferrite de níquel, 26 ± 7 nm para a ferrite de manganês e 11,6 ± 1,6 nm para a magnetite. As propriedades magnéticas revelaram um comportamento superparamagnético à temperatura ambiente para todas as nanopartículas de ferrite, com valores de razão magnética (Mr/Ms) inferiores a 0,1. No entanto, as nanopartículas de níquel apresentaram um comportamento ferromagnético. As nanopartículas de magnetite foram as que apresentaram uma maior magnetização de saturação, com um valor de 62 emu/g, enquanto as ferrites de manganês e de níquel apresentaram valores de 36 emu/g e 23,54 emu/g, respetivamente. Todas as nanopartículas preparadas foram encapsuladas em lipossomas usando diferentes procedimentos, produzindo assim magnetolipossomas distintos. As nanopartículas foram, quer encapsuladas em lipossomas, originando magnetolipossomas aquosos (AMLs) ou cobertas com uma bicamada lipídica, formando magnetolipossomas sólidos (SMLs). Foi desenvolvido um novo método promissor para a síntese de SMLs, tendo sido provada a cobertura das nanopartículas com uma bicamada lipídica usando medidas de FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Förster), usandos lípidos marcados com sondas fluorescentes (com os fluoróforos NBD e Rodamina). Tanto os AMLs como os SMLs, revelaram ser apropriados para aplicações biomédicas, exibindo tamanhos inferiores a 150 nm e uma estreita distribuição de tamanhos. Ambos os magnetolipossomas sólidos e aquosos baseados em ferrites de manganês apresentaram um comportamento superparamagnético à temperatura ambiente, tendo os SMLs apresentado uma elevada magnetização de saturação de 34,16 emu/g, semelhante ao valor obtido para as nanopartículas isoladas de ferrite de manganês. A fusão membranar entre os magnetolipossomas e modelos de membranas celulares (vesículas unilamelares gigantes, GUVs) foi confirmada por ensaios de transferência de energia (FRET), mostrando o potencial destes bionanossistemas para a libertação de fármacos através de fusão membranar. Novos potenciais fármacos antitumorais, derivados de tienopiridinas, com atividade antitumoral previamente comprovada, foram incorporados nos magnetolipossomas sólidos e aquosos, com elevadas eficiências de encapsulação (> 75%). Além disso, ensaios in vitro em várias linhas celulares tumorais humanas, nomeadamente HeLa (carcinoma cervical), MCF-7 (adenocarcinoma da mama), T3M4 (cancro pancreático), HCT15 (adenocarcinoma do cólon) e NCI-H460 (células não-pequenas de cancro do pulmão) revelaram que os magnetoliposomas aquosos baseados em nanopartículas de ferrite de manganês são capazes de libertar os compostos encapsulados e inibir o crescimento das células tumorais. apontando para uma aplicação promissora destes sistemas na terapia oncológica, simultaneamente como agentes de hipertermia e nanoencapsulamento de fármacos antitumorais. Em suma, estes resultados apontam para uma aplicação promissora destes sistemas em terapia oncológica, atuando simultaneamente como nanotransportadores de fármacos antitumorais e como agentes para hipertermia magnética.The author, Ana Rita Oliveira Rodrigues, was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (in portuguese FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia) with the PhD grant SFRH/BD/90949/2012. This work was also funded by the Strategic Funding of the Centre of Physics of University of Minho (CFUM) - PEst-C/FIS/UI0607/2013, and by the Centre of Physics of Minho and Porto Universities (CF-UM-UP) - UID/FIS/04650/2013