Experimentelle Evaluation der Bedeutung des PI3K/AKT-Signalweges für die Tumorstrahlenempfindlichkeit

Hintergrund und Fragestellung/Hypothese Trotz verbesserter Diagnose und Therapiestrategien in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) in den letzten Jahrzehnten liegt das 5-Jahres-Überleben der Patienten bei nur etwa 60 %. Die hohe Mortalität ist zurückzuführen auf eine hohe Rezidivrate nach Radio- und Radiochemotherapie. Experimentelle und klinische Daten zeigen in dieser Tumorentität eine häufige Dysregulation des PI3K/AKT-Signalweges, der an verschiedenen Resistenzmechanismen beteiligt ist. Die Zielmoleküle des Signalweges sind involviert in DNA-Reparatur, Reoxygenierung und Repopulierung. Aufgrund der bekannten Beteiligung des PI3K/AKT-Signalweges an diesen wichtigen radiobiologischen Resistenzmechanismen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit folgenden Fragestellungen: 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Material und Methode/Ergebnisse 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren Für die vorliegende Untersuchung wurde auf Tumormaterial von sechs verschiedenen Plattenepithelkarzinomzelllinien (FaDu, SAS, XF354, UT-SCC-5, UT-SCC-14, UT-SCC-15) aus einer Biobank zurückgegriffen. Analysiert wurden Xenografttumoren, die mit 0, 3, 5 oder 10 Fraktionen bestrahlt worden waren. Die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges wurde mittels Western Blot-Analyse untersucht. Die publizierten Daten der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen, der Pimonidazol hypoxischen Fraktion und der HIF-1α-Proteinexpression wurden mit der pAKT-Expression korreliert. In allen unbehandelten Tumoren konnte pAKT nachgewiesen werden, wobei sich eine intratumorale Heterogenität in der Expression zeigte. Unter fraktionierter Strahlentherapie konnte in dem Panel von sechs Tumorlinien keine einheitliche Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges nachgewiesen werden. Die Expression des endogenen Hypoxiemarkers HIF 1α korrelierte in unbehandelten Tumoren mit der pAKT-Proteinexpression. Kein Zusammenhang wurde zwischen dem Gehalt von pAKT und der Pimonidazol hypoxischen Fraktion sowie der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen gefunden. 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro Die Experimente wurden an den humanen Plattenepithelkarzinomzelllinien Cal33, FaDu, UT-SCC-5 und UT-SCC-14 durchgeführt. In Proliferationsassays und weiteren Zellkultur-experimenten wurde der Effekt des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 auf die Proliferation, die Phosphorylierung von AKT sowie die Dauer des inhibitorischen Effektes untersucht. Das klonogene Zellüberleben wurde bestimmt, indem die Tumorzellen mit 0, 2, 4, 6 oder 8 Gy bestrahlt, 24 Stunden mit dem Inhibitor inkubiert und die entstandenen Kolonien nach 14 Tagen ausgezählt wurden. Eine deutliche Hemmung der Proliferation konnte an den Plattenepithelkarzinomzelllinien schon bei geringen Konzentrationen von Bay 80-6946 gezeigt werden. Die Zelllinie Cal33, welche eine bekannte PI3K Mutation besitzt, reagierte am empfindlichsten auf die Inhibition von PI3K, gefolgt von UT-SCC-14 und FaDu. Nach Inkubation mit 1 µM Bay 80 6946 konnte in keiner der drei Tumorlinien phosphoryliertes AKT nachgewiesen werden. Die Dauer der Inhibition hielt allerdings nur für die Dauer der Inkubation mit Bay 80-6946 an. Das klonogene Zellüberleben nach Bestrahlung wurde durch die Behandlung mit dem Inhibitor nicht signifikant verändert. 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Die Wirksamkeit von Bay 80-6946 wurde in einer Gruppe von neun verschiedenen Kopf-Hals-Tumorlinien sowie zwei NSCLC-Tumorlinien untersucht (A549, Cal33, FaDu, GLF, H460, SAS, SAT, UT-SCC-5, UT-SCC-8, UT-SCC-14 und XF354). Experimenteller Endpunkt war die Tumorwachstumsverzögerung. Bay 80-6946 wurde insgesamt fünfmal im Abstand von 48 Stunden in einer Konzentration von 20 mg/kg KG intravenös injiziert. Die Behandlung begann bei einem Tumordurchmesser von 7 mm. In den drei Tumorlinien Cal33, FaDu und UT-SCC-5 wurde Bay 80-6946 zusätzlich zur Monotherapie auch in Kombination mit fraktionierter Bestrahlung untersucht. Diese Tumormodelle wurden ausgewählt, da sie die intertumorale Heterogenität im Ansprechen auf die alleinige PI3K-Inhibition widerspiegeln. Die Tiere wurden mit 5 x 2 Gy täglich (Gesamtdosis 10 Gy) bestrahlt. Bay 80-6946 wurde einmal wöchentlich in einer Konzentration von 20 mg/kg KG über einen Zeitraum von 29 Tagen verabreicht. Die Behandlung begann eine Woche vor der ersten Bestrahlungsfraktion. Aufgrund des verlängerten Gesamtbehandlungs-zeitraums begann die Behandlung bereits bei einem Tumordurchmesser von 4 mm. In allen Experimentalarmen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Tumoren entnommen und immunhistochemisch auf die radiobiologischen Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion untersucht. Hinsichtlich der Wirksamkeit von Bay 80-6946 auf unbehandelte Plattenepithelkarzinome lassen sich drei Gruppen abgrenzen: starkes Ansprechen bei Cal33, intermediäres Ansprechen (SAS, UT-SCC-8, SAT, FaDu) und fehlendes Ansprechen (XF354, GLF, UT SCC-5, UT-SCC-14). Die NSCLC-Modelle A549 und H460 sprachen moderat auf Bay 80 6946 an. Bei der Kombinationstherapie von Bay 80-6946 mit fraktionierter Bestrahlung deutet sich bei Cal33 ein additiver und bei FaDu ein supraadditiver Effekt an. Bei UT-SCC-5 war in der Kombinationstherapie kein signifikanter Effekt auf das Tumorwachstum nachweisbar. Die immunhistochemischen Analysen zeigten in allen drei Tumorlinien weder bei der Mono- noch bei der Kombinationstherapie einen Einfluss des Inhibitors auf die Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion im Vergleich zur Kontrolle. Schlussfolgerung Die in einem Panel von Experimentaltumoren gewonnen Daten unterstützen derzeit nicht den Einsatz von pAKT als Biomarker, um das Ansprechen auf eine fraktionierte Strahlentherapie vorherzusagen. Vielmehr scheinen die gewonnenen Ergebnisse im Einklang zu den kontroversen und teilweise inkonsistenten Daten anderer Arbeitsgruppen zu stehen. Somit sind trotz klarer radiobiologischer Rationale weitere methodische und translationale Untersuchungen zum potenziellen Stellenwert des AKT-Signalweges als prognostischer Biomarker für die Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren notwendig. Durch die Kombination einer fraktionierten Strahlentherapie mit einem selektiven PI3K-Inhibitior konnte in der vorliegenden experimentellen Arbeit ein deutlicher Effekt auf die Tumorwachstumsverzögerung von Kopf-Hals-Tumoren gezeigt werden. Das Ausmaß des Ansprechens unterschied sich jedoch zwischen den drei untersuchten Tumorlinien und wirft die Frage nach der Ursache dieser Variabilität auf. Vor dem Einsatz eines PI3K-Inhibitors unter fraktionierter Strahlentherapie sollte in weiteren Experimenten der zugrundeliegende Mechanismus der Strahlensensibilisierung geklärt werden. Als zentrale Mechanismen sollten dabei vertiefend der Einfluss der selektiven PI3K-Inhibition auf das Tumormikromilieu sowie die Beteiligung des PI3K-Inhibitors an der Reparatur strahleninduzierter Schäden untersucht werden