Zur chemischen Identifizierung und Visualisierung von Uran-Spezies in Biofilmen und Euglena mutabilis Zellen: Zur chemischen Identifizierung und Visualisierung von Uran-Spezies in Biofilmen und Euglena mutabilis Zellen

Zur Risikoabschätzung anthropogener Uraneinträge in die Umwelt ist ein umfassendes Verständnis der ablaufenden Migrations- und Immobilisationsprozesse notwendig, da eine unkontrollierte Freisetzung von Uran z.B. beim Uranerzabbau zur Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier werden kann. Hierfür sind umfassende Studien zu den Wechselwirkungen von Uran mit verschiedenen Bestandteilen der Umwelt nötig. Dabei spielt neben geologischen Materialien besonders die Biosphäre, im Speziellen die Wechselwirkungen mit Mikroorganismen und Biofilmen, eine große Rolle. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung und Beschreibung natürlicher Biofilme aus realen Uran-kontaminierten Gebieten und deren Auswirkung auf die Uranmigration. Zur Untersuchung von Speziation und Lokalisation des Urans in den ausgewählten Biosystemen wurde in dieser Arbeit vorrangig ein gekoppeltes System aus konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) und laserinduzierter Fluoreszenzspektroskopie (LIFS) angewendet. Dieses System ermöglicht die räumlich aufgelöste Detektion von Fluoreszenzspektren der eingelagerten Uranakkumulationen in heterogenen biologischen Proben. Natürliche Biofilme von zwei urankontaminierten Standorten, dem ehemaligen Uranbergwerk in Königstein (Sachsen) und dem Gebiet der ehemaligen Aufstandsfläche der Gessenhalde (Thüringen), wurden in dieser Arbeit näher untersucht. An beiden Standorten wurden Biofilme bis zu mehreren Zentimetern Dicke unter den extremen Umgebungs-bedingungen in den Minenabwässern vorgefunden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Proben typische Biofilmgemeinschaften aus sauren Minenabwässern und sind exemplarisch für potentiell auftretende Szenarien sowohl für untertage als auch über Tage gelegene Bergbauregionen. Die Wässer beider Standorte waren besonders durch sehr niedrige pH-Werte (Königstein: 2,6 – 3,1; Gessenwiese: 3,6 – 3,9), hohe Sulfat-konzentrationen (Königstein: (707 – 2520) mg/l; Gessenwiese: (3520 – 5887) mg/l), eine vorliegende Kontamination mit Uran (Königstein: (9,3 – 69,5) mg/l; Gessenwiese: (75,1 - 1450) µg/l) und eine Belastung mit zahlreichen weiteren Schwermetallen charakterisiert. An beiden Standorten konnte in den Minenwässern die hochmobile, gelöste Uranspezies Uranylsulfat (UO2SO4) als dominierend nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Biofilmstruktur sowie möglichen Uraneinlagerungen und Ausfällungen mittels des CLSM/LIFS-Systems zeigten, besonders bei den Biofilmen aus Königstein, deren Mikroorganismen kaum Eigenfluoreszenz aufwiesen, Probleme mit der Visualisierung der Biofilmstruktur. Aufgrund der Instabilität vieler kommerzieller Fluoreszenzfarbstoffe bei niedrigen pH-Werten war eine gezielte Anfärbung der Mikroorganismen in den sauren Biofilmen nicht möglich, ohne den pH-Wert der Biofilmproben anzuheben, was die Probenchemie maßgeblich verändert. In Kooperation mit der Firma DYOMICS (Jena, Deutschland) wurden neue, kommerziell nicht erhältliche, säurestabile Farbstoffe erstmals hinsichtlich ihrer Eignung zur Anfärbung von Mikroorganismen in sauren Biofilmen ohne Veränderung des pH-Wertes sowie der sonstigen Probenchemie getestet. Die neuen Farbstoffe DY-601XL, V07-04118, V07-04146 und DY-613 zeigten eine Eignung für solche Färbungen, da sie eine intensive Anfärbung der Mikroorganismen bei niedrigen pH-Werten unter pH 3 – 4 herbeiführen und außerhalb des Emissionsbereiches von Uran fluoreszieren. Die Strukturen der phototrophen Biofilme der Gessenwiese, welche viele autofluoreszierende Mikroorganismen enthielten, konnten mittels CLSM/LIFS sehr gut dargestellt werden. Aufgrund der kontinuierlichen, ungepulsten Anregung zeigten sich starke Überlagerungen der Eigenfluoreszenzsignale der Probenbiologie mit den zu untersuchenden Uransignalen. Eine Auftrennung dieser Signale zur spezifischen Urananalytik war bei den Urankonzentrationen, wie sie in Biofilmen aus natürlichen, durch saure Minenabwässer belasteten Gebieten vorkamen, aufgrund verschiedener technischer Limitationen des gekoppelten CLSM/LIFS-Systems nicht möglich. Um den umweltrelevanten Charakter dieser Studien beizubehalten, wurden die natürlichen Biofilmproben jedoch nicht künstlich mit erhöhten Urankonzentrationen versetzt, stattdessen wurde besonderer Wert auf die Beschreibung der realen Wechselwirkungen mit originalen, unveränderten Biofilmen gelegt. Aufgrund der Komplexität der natürlichen Biofilmproben sollten die Wechselwirkungen von Uran mit Monokulturen eines ausgewählten eukaryotischen Einzellers, welcher typisch in sauren Uran- und schwermetallbelasteten Wässern wie z.B. in den Biofilmen von der Gessenwiese anzutreffenden ist, detaillierter untersucht werden. Erstmalig wurden hierzu in dieser Arbeit die Wechselwirkungen von Uran mit Euglena mutabilis Zellen untersucht. Dabei wurde die Fähigkeit der Euglena-Zellen zur Bioakkumulation des Urans im pH-Wertbereich 3 – 6 in den Hintergrundmedien Natriumperchlorat (9 g/l) oder Natriumsulfat (3,48 g/l) an lebenden Zellen untersucht. Uran wurde hierbei in einer für saure Minenabwässer relevanten Konzentration von 0,01 mM in der Ausgangslösung vorgelegt. Unabhängig vom Medium konnte bei sauren pH-Werten um pH 3 – 4 über 90 % des vorgelegten Urans aus den Probelösungen abgetrennt werden. Vor dem Hintergrund einer möglichen Anwendung dieser Zellen zur Reinigung kontaminierter saurer Minenabwässer ist die hohe Immobilisierungsrate für Uran speziell im sauren pH-Bereich besonders attraktiv. Lebende, metabolisch aktive Zellen zeigten sich innerhalb dieser Studie in der Lage, größere Mengen Uran zu binden als tote Zellbiomasse. So wurden in Bioakkumulations-versuchen mit erhöhten Urankonzentrationen von 0,5 mM maximale Uranakkumulationen an den Euglena-Zellen von (33,16 ± 0,2) mg/g für lebende Zellen und (12,97 ± 0,7) mg/g für tote Zellen gemessen. An toten Zellen findet dabei ein reiner Biosorptionsprozess des Urans an die vorhandenen Bindungsstellen der Zellen statt, welcher innerhalb weniger Minuten (< 20 min) abgeschlossen ist. Bei lebenden, metabolisch aktiven Zellen wurde deutlich mehr Zeit benötigt bis die gleiche Uranmenge wie bei toten Zellen aufgenommen wurde. Dies ist ein Indiz für einen anfänglichen Abwehrmechanismus und einen insgesamt aktiven Umgang der lebenden Zellen mit dem Uran. Bei Bioakkumulationsversuchen an Euglena mutabilis Zellen unter Verwendung von realen, sauren, urankontaminierten Wässern wurden signifikant schlechtere Immobilisations-raten für Uran detektiert ((0 – 3,6) mg U/gEuglenaBtm). Ursache hierfür ist der Wettbewerb des Urans mit den vielfältigen anderen Inhaltstoffen in den natürlichen Wässern um die verfügbaren Sorptionsstellen an den Zellen. Dies verdeutlicht die Schwierigkeit, Erkenntnisse aus Laborexperimenten direkt auf natürliche Prozesse anzuwenden und verdeutlicht die Notwendigkeit in zukünftigen Untersuchungen, auf eine entsprechende Umweltrelevanz der Versuchsbedingungen zu achten. Die Speziation des an den Euglena-Zellen akkumulierten Urans, wurde mittels laserinduzierter Fluoreszenzspektroskopie (LIFS) untersucht. Es zeigte sich, dass unabhängig vom Hintergrundmedium, Lebenszustand und pH-Wert eine vergleichbare neue Uranspezies an den Zellen gebildet wird. Die detektierten Emissionsmaxima des Uranfluoreszenzsignals, gemessen an den Euglena-Zellen lagen bei 478,4 nm, 495,6 nm, 517,1 nm, 540,4 nm, 565,3 nm, 590,1 nm. Durch den Vergleich der Daten aus den LIFS-Messungen mit Referenzwerten, konnte die gebildete Uranspezies auf eine Anbindung durch (organo)phosphatische und/oder carboxylische funktionelle Gruppen eingegrenzt werden. Mit Hilfe der zeitaufgelösten FT-IR-Spektroskopie wurde erstmals der Biosorptionsprozess direkt an der Grenzfläche zwischen Euglena-Zellen und Uranlösung untersucht. Dabei konnte die carboxylische Anbindung des Urans an toten Zellen nachgewiesen werden. Ein Ausschluss der (organo)phosphatischen Komplexierung konnte jedoch mit dieser Methode nicht geführt werden. Untersuchungen zur Lokalisation des Urans an bzw. in den Zellen, mittels der gekoppelten CLSM/LIFS-Technik zeigten erstmals ein Indiz für die intrazelluläre Akkumulation von Uran in den lebenden Zellen. Ergänzende TEM/EDX-Messungen bestätigten die intrazelluläre Aufnahme und belegen eine Akkumulation in runden bis ovalen Zellorganellen, bei denen es sich vermutlich um Vakuolen oder Vakuolen-ähnliche Vesikel handelt. An den toten Zellen konnte mit diesen Methoden kein Uran detektiert werden. Dies lässt auf eine passive, homogen verteilte Biosorption des Urans an die verfügbaren Bindungsplätze an der Zelloberfläche der toten Biomasse schließen. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen Beitrag zum Prozessverständnis der Wechselwirkungen von Uran mit Biofilmen und speziell mit Euglena mutabilis Zellen. Auf Grundlage der erhaltenen Erkenntnisse können Risiken in natürlichen kontaminierten Gebieten besser eingeschätzt werden und Vorhersagen zum Migrationsverhalten des Urans entsprechend der vorliegenden Bedingungen optimiert werden