Funktionale und molekulare Charakterisierung des Pad-Proteins von Legionella pneumophila

In der vorliegenden Arbeit wurde das Pad-Protein von Legionella pneumophila mit zell- bzw. molekularbiologischen sowie immunochemischen Methoden charakterisiert. Mittels Einbau des mutierten Pad-Locus, kodiert auf dem Plasmid pCS-25, in das Genom der L. pneumophila Stämme WH88 (Serogruppen 6) bzw. WH89 (Serogruppe 10) wurden je drei Pad-negative Mutanten gewonnen. Mit Hilfe der PCR, des Southernblot bzw. ELISA wurde der korrekte Austausch der Wildtypsequenz gegen den mutierten Bereich des Proteins nachgewiesen. Die Infektionsversuche mit den Mutanten bestätigten die Vermutung, dass das Protein eine Rolle an der initialen Kontaktaufnahme von L. pneumophila in den natürlichen Wirt, A. castellanii, hat. Dabei wurden signifikant niedrigere Aufnahmeraten der Mutanten im Vergleich zu den beiden Wildtypen beobachtet. Durch Kultivierung und Infektion des Ursprungstammes L. pneumophila Corby, der pad-negativen Mutante CP7 und der Pad-komplementierten Mutante bei 25°C, 30°C bzw. 37°C wurde der Einfluss der Temperatur auf die Funktion des Proteins untersucht. Die Ergebnisse zeigten dabei einen signifikanten Anstieg der Aufnahmeraten bei Vergleich von 25°C und 30°C bzw. 25°C und 37°C. Keine Signifikanz trat zwischen 30°C und 37°C auf. Ein zweiter Aspekt dieses Versuchs war die Prüfung der Infektionsrate in Abhängigkeit von der Proteinexpression unter dem Einfluss der Wachstumsphase. Dabei wurden durch vergleichende Infektion von A. castellanii mit exponentiellen (EP) bzw. stationäre Phase-Kulturen (SP) in diesem Versuch signifikante Unterschiede zwischen dem Wildtyp Corby und der Mutante CP7 bzw. zwischen der Mutante CP7 und der Pad+-Komplementante bei den jeweils untersuchten Temperaturen beobachtet. Keine signifikanten Unterschiede waren zwischen Wildtyp und Pad-Komplementante feststellbar. Zur Speziesübergreifenden Charakterisierung des Proteins Pad wurde das Wildtyplocus-kodierende Plasmid (pCS31) in die fünf non-pneumophila Stämme L. parisiensis (H962); L. bozemanii (L99-343); L. bozemanii (Frankreich5); L. longbeachae (A46) und L. tauriniensis (Koper11) durch Elektroporation übertragen. Im anschließenden ELISA wurde die Expression des Proteins Pad in den komplementierten Transformanten nachgewiesen. Die Infektionsversuche ergaben überwiegend signifikant höhere Aufnahmeraten der Pad-komplementierten Klone im Vergleich zu den Pad-negativen Wildtypen. Die Infektionsversuche zeigen, dass Pad nicht an der intrazellulären Replikation beteiligt ist. Die Ergebnisse der Infektionsversuche wurden parallel dazu durch mikroskopische Untersuchung intrazellulärer Bakterien bestätigt. Die Vermutung, dass die Expression von Pad als infektionsbeteiligtes Protein beim Übergang in die virulente Phase induziert wird, wurde durch die Kultivierung über 6 Tage bis in die späte stationäre Phase bestätigt. Die Kulturen des L. pneumophila Stammes JR32 zeigen im ELISA mit dem Pad-spezifischen Antikörper 61-1 ab der spätexponentiellen Phase (nach 24 Stunden) eine ansteigende Extinktion. Im Gegensatz dazu wurde für die GacA (LetA)-negative Mutante JR32gac- eine gleichbleibend hohe Expression des Proteins Pad über den gesamten Versuchszeitraum gemessen, was erste Hinweise liefert, dass Pad gacA bzw. letA-reguliert ist. Ein zellschädigender Einfluss der Bakterien auf die Atmungskette der Amöbenzelle zu frühen Zeitpunkten der Infektion (5, 30, 120 min) wurde mittels des Cell Titer Blue Cell Viability Assays festgestellt. Die Infektion mit hitzeabgetöteten Legionellen ergab dabei eine Toxizität unter 10 % bei allen drei untersuchten Zeitpunkten. Nach Infektion mit EP- als auch mit SP-Kulturen des Wildtyps Corby wurde eine maximale Toxizität zwischen 30 % und 40 % (120 min) gemessen. Bei der Mutante wurde eine Toxizität von ca. 28% der SP-Kultur nach 120 min Infektion beobachtet. Für die weiterführende Charakterisierung des Pad-Proteins wurde eine Maus mit dem rekombinanten Protein immunisiert. Dabei wurden zusätzlich zum vorhandenen Antikörper 61-1 die Antikörper 83-1 und 83-2 gewonnen. Bei diesen handelt es sich um IgG-Antikörper. Die durchgeführten Tests lassen vermuten, dass es sich um, in der Reaktion von Mak 61-1, ähnliche Antikörper handelt. Zur strukturellen Analyse des Pad-Proteins wurde mit zwei unterschiedlichen Phagenbibliotheken nach möglichen Epitopen für den Pad-spezifischen Antikörper 61-1 gesucht. Dabei wurde unabhängig voneinander mit beiden Phagen-Bibliotheken ein Epitop (L2) im C-terminalen Bereich ermittelt. Das Einfügen von Zufallsmutationen ließ keine Eingrenzung des Epitops zu. Da es jedoch dem, mit Mak 61-7 im Peptidspotting von C. Steudel (2001) ermittelten, Epitop C3 entspricht, ist davon auszugehen, dass es sich tatsächlich um das zweite putative Epitop für den Antikörper handelt. Des Weiteren wurde mit beiden Phagen-Bibliotheken das Epitop (L1) lokalisiert. Eine Eingrenzung dieses Epitops mittels Einfügen von Zufallsmutanten war nicht möglich. Durch site-spezifische Mutation wurden alle Aminosäuren des Epitops C1 (STEUDEL, 2001) in der putativen Signalsequenz ausgetauscht. Bei Testung der Mutanten auf ihre Bindungsfähigkeit an den Antikörper 61-1 im ELISA konnte eine Beteiligung der Aminosäuren Leucin11, Phenylalanin15, Glycin18 und Prolin20 beobachtet werden. Die Ergebnisse bestätigen, dass Pad an frühen Phasen der Infektion von A.castellanii durch L.pneumophila beteiligt ist. Es ist zu vermuten, dass dieses Pad-Protein einen Selektionsvorteil für den am häufigsten nachweisbaren Vertreter dieser Familie darstellt