Untersuchung von Stoffwechselparametern und Lipoproteinen im Blutserum von einlings- und zwillingsträchtigen Merino- und Schwarzköpfigen Fleischschafen im peripartalen Zeitraum

Alexandra Flocke Untersuchung von Stoffwechselparametern und Lipoproteinen im Blutserum von einlings- und zwillingsträchtigen Merino- und Schwarzköpfigen Fleischschafen im peripartalen Zeitraum Medizinische Tierklinik, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2012 (94 Seiten, 15 Abbildungen, 8 Tabellen, 199 Literaturangaben, 12 Tabellen im Anhang) Schlüsselwörter: Lipoproteine, Schaf, Stoffwechsel, Endotoxin, Ketose Problemstellung: Der Lipoproteinstatus in der kritischen Phase der Hochträchtigkeit wurde beim Schaf bisher nur wenig untersucht. Die Fähigkeit der Lipoproteine, sowohl Lipide zu transportieren und im Körper umzuverteilen, als auch ihre Rolle in der Endotoxinneutralisation machen sie zu einem wichtigen Parameter in stoffwechselbelasteten Situationen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Lipoproteinstatus zweier verschiedener Leistungsrassen zu analysieren und zu prüfen, ob und inwiefern peripartal Unterschiede bei Ein- und Zwillingsträchtigkeiten bestehen. Zusätzlich werden die Endotoxine der Tiere bestimmt und mögliche Zusammenhänge mit der Stoffwechselsituation und dem Lipoproteinstatus evaluiert. Tiere, Material und Methoden: Untersucht wurden gesunde einlingsträchtige Merinofleischschafe (MFS1), zwillingsträchtige Merinofleischschafe (MFS2) sowie zwillingsträchtige Schwarzköpfige Fleischschafe (SKF2). Im Abstand von je sieben Tagen wurden den Tieren im Zeitraum von der 5. Woche a.p. bis eine Woche p.p. Blutproben aus der V. jugularis externa entnommen. Aus dem Serum wurden die Konzentrationen von β-Hydroxybutyrat (BHB), Glucose, Freie Fettsäuren (FFS), Triacylglycerol (TG), Cholesterol, Bilirubin, Gesamtprotein (alle Hitachi 912), Insulin (RIA-Kit, Firma IBL, Hamburg), α- und β-Lipoproteine (LIPIDOPHOR All In12®, - ohne prä-β-Lipoproteine), freies Endotoxin (LAL-Test) und Anti-Lipid A Antikörper (ALAAK; ELISA) bestimmt. Ergebnisse: Die α-Lipoproteinkonzentration stieg bei den MFS1 vor dem Ablammen signifikant an und erreichte eine Konzentration von = 208,0 ± 40,1 mg/dl (1. Woche a.p.). Die MFS2 wiesen vor dem Lammen einen konstanten Verlauf zwischen = 180,4 ± 31,1 mg/dl (5. Woche a.p.) und = 196,1 ± 42,1 mg/dl (3. Woche a.p.) auf. Die SKF2 zeigten in der 5. Woche a.p. mit = 206,5 ± 39,0 mg/dl eine größtenteils signifikant höhere Konzentration gegenüber den folgenden Untersuchungszeitpunkten. Bei beiden Rassen ließ sich bei den Zwillingsmuttern nach dem Lammen ein signifikanter Abfall der α-Lipoproteinkonzentration auf = 144,3 ± 46,1 mg/dl (MFS2) bzw. = 170,2 ± 48,8 mg/dl (SKF2) feststellen. Es bestand eine gesicherte Korrelation zu Cholesterol. Die β-Lipoproteinkonzentration lag in der 1. Woche p.p. bei den Zwillingsmuttern (MFS2 und SKF2) signifikant niedriger als vor dem Lammen. Die SKF2 wiesen in der 5. und 4. Woche a.p. signifikant niedrigere Konzentrationen als die MFS1 auf. Gesicherte Korrelationen bestanden zu TG, Cholesterol und ALAAK (MFS1). Für die α-Lipoproteinkonzentration wurde ein Referenzbereich von 144,3 – 208,0 mg/dl und für die β-Lipoproteinkonzentration von 13,6 – 28,0 mg/dl bei Muttertieren der beschriebenen Rassen ermittelt. Ausgenommen die Insulinkonzentration in der 1. Woche a.p. bestanden keine signifikanten Differenzen zwischen MFS1 und MFS2. Im Vergleich der Rassen zeigten sich signifikante Differenzen in der Glucosekonzentration in der 2. Woche a.p. und in der Konzentration von Bilirubin in der 3. und 1. Woche a.p.. Die BHB-Konzentration zeigte einen konstanten Verlauf und stieg bei den MFS1 bis auf = 0,96 ± 0,36 mmol/l eine Woche p.p., bei den MFS2 auf = 0,73 ± 0,35 mmol/l und bei den SKF2 auf = 0,63 ± 0,14 mmol/l eine Woche a.p. signifikant an. Gesicherte Korrelationen bestanden zu FFS (MFS2) und Insulin (MFS2; SKF2). Die Glucosekonzentration zeigte sich bei den Zwillingsmuttern nach zunächst abfallenden Konzentrationen in der Hochträchtigkeit eine Woche p.p. signifikant höher ( = 3,63 ± 0,59 mmol/l; MFS2 und = 3,28 ± 0,42 mmol/l; SKF2) als vor dem Lammen. Gesicherte Korrelationen ließen sich zu FFS (MFS1; MFS2), BHB (MFS2) und dem Zeitpunkt der Untersuchung (MFS2; SKF2) feststellen. Die FFS-Konzentration stieg bei den SKF2 zur 1. Woche a.p. auf = 265 ± 131 μmol/l an, fiel eine Woche p.p. signifikant auf = 128 ± 95 μmol/l ab und korrelierte gesichert mit TG. Die TG-Konzentration fiel von der 1. Woche a.p. bis zur 1. Woche p.p. signifikant auf = 0,19 mmol/l (MFS1; SKF2) bzw. = 0,18 ± 0,05 mmol/l (MFS2) ab und korrelierte mit Gesamtprotein (MFS1), Cholesterol (MFS1; MFS2), β-Lipoproteinen (MFS1; MFS2) und freiem Endotoxin (MFS1). Die Cholesterolkonzentration fiel eine Woche p.p. bei den Zwillingsmuttern signifikant ab, bei den MFS1 war der Verlauf konstant. Die Bilirubinkonzentration stieg eine Woche p.p. signifikant an (MFS1; MFS2) und korrelierte mit der Konzentration von freiem Endotoxin. Das Gesamtprotein sank zum Zeitpunkt des Ablammens hin signifikant ab, erreichte jedoch eine Woche p.p. wieder seine Ausgangskonzentration. Eine gesicherte Korrelation konnte mit ALAAK festgestellt werden (MFS2; SKF2). Freies Endotoxin konnte zu jedem Zeitpunkt der Untersuchungsreihe nachgewiesen werden. Dabei lagen die festgestellten Konzentrationen bei x̃ = 0,06 – 1,30 EU/ml. Eine gesicherte Korrelation fand sich mit der Konzentration der ALAAK (MFS2). ALAAK konnten ebenfalls zu jedem Zeitpunkt in Konzentrationen von x̃ = 22,2 - 56,8 (OD-Wert) nachgewiesen werden. Fazit: Die Lipoproteinkonzentrationen in den einzelnen Gruppen zeigten sich a.p. zunächst regulativ den erhöhten peripartalen Belastungen des Lipidstoffwechsels angepasst, p.p. demonstrierte auch die Abnahme der Lipoproteinkonzentrationen das Ende der lipolytischen Aktivität bei den Schafen. Die vorliegenden Ergebnisse der Stoffwechselparameter lassen auf eine stärkere Belastung der Zwillingsmuttern schließen, welche auch die Lipoproteine mit einbezieht. Freies Endotoxin konnte auch bei gesunden Schafen zwar zu jedem Zeitpunkt nachgewiesen, eine gesicherte Korrelation mit der Lipoproteinkonzentration jedoch nicht festgestellt werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Physiologische Gravidität des Schafes 4 2.2 Stoffwechsel von Mutterschafen in der Hochträchtigkeit 5 2.3 Stoffwechselparameter 6 2.3.1 β-Hydroxybutyrat 6 2.3.2 Glucose 7 2.3.3 Insulin 10 2.3.4 Freie Fettsäuren 12 2.3.5 Triacylglycerol 13 2.3.6 Cholesterol 14 2.3.7 Bilirubin 15 2.3.8 Gesamtprotein 17 2.4 Lipoproteine 18 2.4.1 Definition von Lipoproteinen 18 2.4.2 Stoffwechsel der Lipoproteine 21 2.4.2.1 Chylomikronen 21 2.4.2.2 Very-Low-Density-Lipoproteins 22 2.4.2.3 Low-Density-Lipoproteins 23 2.4.2.4 High-Density-Lipoproteins 24 2.4.3 Besonderheiten der Lipoproteine beim Schaf 24 2.5 Endotoxin 27 2.5.1 Definition von Endotoxin 27 2.5.2 Aufbau von Endotoxin 27 2.5.3 Herkunft und Wirkung des Endotoxins 28 2.5.4 Inaktivierung und Elimination des Endotoxins 29 2.5.5 Beziehung zwischen Endotoxin und Fettstoffwechsel 30 3 Tiere, Material und Methoden 32 3.1 Versuchsgut 32 3.2 Versuchsanordnung 33 3.3 Material 34 3.4 Methodik 34 3.4.1 Gesundheitszustand der Versuchsgruppen 34 3.4.2 Bestimmungsmethoden klinisch-chemischer Parameter 34 3.4.3 Bestimmung der Lipoproteine 35 3.4.4 Bestimmung von freiem Endotoxin 37 3.4.5 Bestimmung von Anti-Lipid A Antikörpern 38 3.5 Statistische Auswertung 39 4 Ergebnisse 41 4.1 Tierbestand 41 4.2 Stoffwechselparameter 41 4.2.1 β-Hydroxybutyrat 41 4.2.2 Glucose 44 4.2.3 Insulin 46 4.2.4 Freie Fettsäuren 48 4.2.5 Triacylglycerol 50 4.2.6 Cholesterol 52 4.2.7 Bilirubin 54 4.2.8 Gesamtprotein 56 4.3 Lipoproteine 58 4.3.1 α-Lipoproteine 58 4.3.2 ß-Lipoproteine 60 4.4 Endotoxin 62 4.5 Anti-Lipid A Antikörper 64 5 Diskussion 66 5.1 Versuchsprinzip 66 5.2 Tiere und Versuchsbedingungen 66 5.3 Methodenkritik 67 5.4 Stoffwechselparameter 68 5.4.1 β-Hydroxybutyrat 68 5.4.2 Glucose 71 5.4.3 Insulin 72 5.4.4 Freie Fettsäuren 74 5.4.5 Triacylglycerol 76 5.4.6 Cholesterol 78 5.4.7 Bilirubin 79 5.4.8 Gesamtprotein 81 5.5 Lipoproteine 83 5.5.1 α-Lipoproteine 83 5.5.2 β-Lipoproteine 86 5.6 Endotoxin 87 5.7 Anti-Lipid A Antikörper 89 6 Zusammenfassung 91 7 Summary 93 8 Literaturverzeichnis 95 9 Anhang 116 9.1 Stoffwechselparameter 116 9.1.1 β-Hydroxybutyrat 116 9.1.2 Glucose 117 9.1.3 Insulin 118 9.1.4 Freie Fettsäuren 119 9.1.5 Triacylglycerol 120 9.1.6 Cholesterol 121 9.1.7 Bilirubin 122 9.1.8 Gesamtprotein 123 9.2 Lipoproteine 124 9.2.1 α-Lipoproteine 124 9.2.2 β-Lipoproteine 125 9.3 Endotoxin 126 9.4 Anti-Lipid A Antikörper 127Alexandra Flocke Evaluation of metabolic parameters and lipoproteins in the serum of merino and blackhead sheep for meat production with one or two lambs in the peripartal period Large Animal Clinic for Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in February 2012 (94 pages, 15 figures, 8 tables, 199 references, 12 tablets in the appendix) Keywords: lipoproteins, sheep, metabolism, endotoxin, ketosis Objective: The lipoprotein status in the critical phase of the peripartal period of sheep has been few reviewed. The ability of lipoproteins to transport and redistribute lipids in the organism and their capacity for endotoxinneutralisation makes them a considerable parameter in metabolic bonded situations. The objective of this research is to show the lipoprotein status of two competitive breeds and to proof if and to what extend differences between ewes with one and two lambs exist. Additionally, the endotoxic situation is assigned and possible correlations with the metabolic system and the lipoprotein status are evaluated. Animals, materials and methods: The research contains healthy merino sheep with one lamb (MFS1), merino sheep with two lambs (MFS2) and blackhead sheep with two lambs (SKF2). At intervals of seven days, blood samples out of the V. jugularis externa were taken from the animals in a period from the 5th week a.p. to one week p.p.. Concentrations in the serum of the following parameters were defined: β-hydroxybutyrat (BHB), glucose, free fatty acids (FFS), triacylglycerol (TG), cholesterol, bilirubin, total protein (all Hitachi 912), insulin (RIA-kit, IBL, Hamburg), α- and β-lipoprotein (LIPIDOPHOR All In12® - without pre-β-lipoprotein), free endotoxin (LAL-test) and anti-lipid A antibodies (ALAAK). Results: The concentration of α-lipoproteins of the MFS1 increased significantly before parturition and finally reached 208,0 ± 40,1 mg/dl (1st Week a.p.). The group of MFS2 showed a constant deviation between = 180,4 ± 31,1 mg/dl (5th Week a.p.) and = 196,1 ± 42,1 mg/dl (3rd week a.p.) before parturition. The SKF2 evidenced with a concentration of = 206,5 ± 39,0 mg/dl in the 5th week a.p. a predominantly significant higher result as during following points in time. Both groups carrying twins showed a significant decrease of the α-lipoprotein concentration down to = 144,3 ± 46,1 mg/dl (MFS2) or = 170,2 ± 48,8 mg/dl (SKF2) after parturition. There were statistically reliable correlations between the α-lipoprotein concentration and cholesterol. The β-lipoprotein concentration from both twin pregnant groups had been significantly lower one week after parturition than before parturition. The results of the SKF2 in week 5 and 4 a.p. were significantly lower than those of the MFS1. Reliable correlations could be determined with TG, cholesterol and ALAAK (MFS1). An α-lipoprotein reference range for ewes of the introduced breeds could be determined from 144,3 - 208,0 mg/dl and for β-lipoproteins from 13,6 - 28,0 mg/dl. There were no significant differences between MFS1 and MFS2 except the concentration of insulin in the 1st week a.p.. In the comparison of the different breeds, significant differences in the concentration of glucose (2nd week a.p.) and bilirubin (3rd week a.p. and 1st week a.p.) could be shown. The concentration of BHB showed a constant deviation and increased significantly to = 0,96 ± 0,36 mmol/l (MFS1; 1st week p.p.), = 0,73 ± 0,35 mmol/l (MFS2, 1st week a.p.) or = 0,63 ± 0,14 mmol/l (SKF2, 1st week a.p.), respectively. Reliable correlations existed with FFS (MFS2) and insulin (MFS2; SKF2). The concentration of glucose of the twin pregnant ewes decreased initially before parturition and increased significantly again in the 1st week p.p. ( = 3,63 ± 0,59 mmol/l; MFS2 and = 3,28 ± 0,42 mmol/l; SKF2). Reliable correlations had been determined with FFS (MFS1; MFS2), BHB (MFS2) and the time of sampling (MFS2; SKF2). Concentrations of FFS increased in the group of SKF2 to = 265 ± 131 μmol/l in the 1st week a.p., decreased again significantly to = 128 ± 95 μmol/l one week p.p. and showed a correlation with TG. The TG concentration decreased significantly from one week a.p. to one week p.p. down to = 0,19 mmol/l (MFS1; SKF2) and = 0,18 ± 0,05 mmol/l (MFS2), respectively. A reliable correlation existed between TG and total protein (MFS1), cholesterol (MFS1; MFS2), β-lipoproteins (MFS1; MFS2) and free endotoxin (MFS1). Both twin pregnant groups had a significant decrease in the cholesterol concentration one week after parturition, in contrast the group of MFS1 showed a constant deviation. The concentration of bilirubin increased significantly one week p.p. (MFS1; MFS2) and showed a reliable correlation with the concentration of free endotoxin. Total protein decreased significantly towards parturition, but reached its initial concentration again one week p.p.. A statistically reliable correlation could be determined with ALAAK (MFS2; SKF2). Free endotoxin could be detected at any point of the exploration. The observed concentrations ranged from x̃ = 0,06 – 1,30 EU/ml. A reliable correlation could be shown with the concentration of ALAAK (MFS2). ALAAK was detected as well in concentrations from x̃ = 22,2 - 56,8 (OD-value) in any taken sample. Conclusion: The lipoprotein concentrations in each group appeared a.p. initially adapted to the peripartal bonds of the increased lipid metabolism. After parturition, the decrease in lipoprotein concentrations, too, demonstrated the end of the lipolytic activity of the ewes. The results of the metabolic parameters lead to the conclusion of a stronger liability of the ewes with twins. This is also valid for the lipoproteins. Free endotoxin could be detected in healthy sheep at any time, but a reliable correlation with the concentration of lipoproteins was not visible.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Physiologische Gravidität des Schafes 4 2.2 Stoffwechsel von Mutterschafen in der Hochträchtigkeit 5 2.3 Stoffwechselparameter 6 2.3.1 β-Hydroxybutyrat 6 2.3.2 Glucose 7 2.3.3 Insulin 10 2.3.4 Freie Fettsäuren 12 2.3.5 Triacylglycerol 13 2.3.6 Cholesterol 14 2.3.7 Bilirubin 15 2.3.8 Gesamtprotein 17 2.4 Lipoproteine 18 2.4.1 Definition von Lipoproteinen 18 2.4.2 Stoffwechsel der Lipoproteine 21 2.4.2.1 Chylomikronen 21 2.4.2.2 Very-Low-Density-Lipoproteins 22 2.4.2.3 Low-Density-Lipoproteins 23 2.4.2.4 High-Density-Lipoproteins 24 2.4.3 Besonderheiten der Lipoproteine beim Schaf 24 2.5 Endotoxin 27 2.5.1 Definition von Endotoxin 27 2.5.2 Aufbau von Endotoxin 27 2.5.3 Herkunft und Wirkung des Endotoxins 28 2.5.4 Inaktivierung und Elimination des Endotoxins 29 2.5.5 Beziehung zwischen Endotoxin und Fettstoffwechsel 30 3 Tiere, Material und Methoden 32 3.1 Versuchsgut 32 3.2 Versuchsanordnung 33 3.3 Material 34 3.4 Methodik 34 3.4.1 Gesundheitszustand der Versuchsgruppen 34 3.4.2 Bestimmungsmethoden klinisch-chemischer Parameter 34 3.4.3 Bestimmung der Lipoproteine 35 3.4.4 Bestimmung von freiem Endotoxin 37 3.4.5 Bestimmung von Anti-Lipid A Antikörpern 38 3.5 Statistische Auswertung 39 4 Ergebnisse 41 4.1 Tierbestand 41 4.2 Stoffwechselparameter 41 4.2.1 β-Hydroxybutyrat 41 4.2.2 Glucose 44 4.2.3 Insulin 46 4.2.4 Freie Fettsäuren 48 4.2.5 Triacylglycerol 50 4.2.6 Cholesterol 52 4.2.7 Bilirubin 54 4.2.8 Gesamtprotein 56 4.3 Lipoproteine 58 4.3.1 α-Lipoproteine 58 4.3.2 ß-Lipoproteine 60 4.4 Endotoxin 62 4.5 Anti-Lipid A Antikörper 64 5 Diskussion 66 5.1 Versuchsprinzip 66 5.2 Tiere und Versuchsbedingungen 66 5.3 Methodenkritik 67 5.4 Stoffwechselparameter 68 5.4.1 β-Hydroxybutyrat 68 5.4.2 Glucose 71 5.4.3 Insulin 72 5.4.4 Freie Fettsäuren 74 5.4.5 Triacylglycerol 76 5.4.6 Cholesterol 78 5.4.7 Bilirubin 79 5.4.8 Gesamtprotein 81 5.5 Lipoproteine 83 5.5.1 α-Lipoproteine 83 5.5.2 β-Lipoproteine 86 5.6 Endotoxin 87 5.7 Anti-Lipid A Antikörper 89 6 Zusammenfassung 91 7 Summary 93 8 Literaturverzeichnis 95 9 Anhang 116 9.1 Stoffwechselparameter 116 9.1.1 β-Hydroxybutyrat 116 9.1.2 Glucose 117 9.1.3 Insulin 118 9.1.4 Freie Fettsäuren 119 9.1.5 Triacylglycerol 120 9.1.6 Cholesterol 121 9.1.7 Bilirubin 122 9.1.8 Gesamtprotein 123 9.2 Lipoproteine 124 9.2.1 α-Lipoproteine 124 9.2.2 β-Lipoproteine 125 9.3 Endotoxin 126 9.4 Anti-Lipid A Antikörper 12