Denaturierende Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) als Methode zur Mutationssuche in den Genen MLH1 und MSH2 bei Patienten mit hereditärem nicht-polypösem kolorektalem Karzinom (HNPCC).: Ergebnisse bei 28 Patienten.

Das hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) bildet mit 2-3 % aller kolorektalen Karzinomen die häufigste Form der erblichen Darmkrebserkrankungen. Sie wird meist durch Mutationen in den Genen MLH1 und MSH2 verursacht. Beide Gene codieren zusammen mit anderen Genen (MSH6, MLH3, PMS1 und PMS) für Proteine des DNA-Mismatch-Repair-Systems, welches wichtig für die Stabilität des Genoms ist. Um Träger dieser Mutationen zu identifizieren und frühzeitig Vorsorgeprogrammen zuzuführen, ist ein zuverlässiges Auswahlverfahren notwendig. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Methode der denaturierenden Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) geeignet ist, um nach Mutationen in den Genen MLH1 und MSH2 zu suchen. Bei 26 weiblichen Patienten und 2 männlichen Probanden im Alter von 23 bis 69 Jahren, die an einem Mammakarzinom (26), einer Dysplasie der Portio (1) sowie an einem Ovarialkarzinom (1) erkrankt waren, und bei deren Familienmitglieder gehäuft Tumoren auftraten, wurden die Gene MLH1 und MSH2 mittels DHPLC gescreent. Dabei wurden alle Exons von MLH1 außer 3, 5-7, 9-10, 14-15 und 18 sowie alle Exons von MSH2 außer Exon 1-2, 4, 9 und 14 einschließlich der flankierenden Exon-/Intron-Grenzen untersucht. Bei insgesamt 41 einzelnen Patientenkurven wich das Muster des DHPLC-Chromatogramms als Hinweis auf eine Genveränderung durch mehrfache oder verbreiterte Peaks vom normalen Kurvenverlauf ab. Die sich daran anschließende DNA-Sequenzanalyse ergab bei 35 der auffälligen Kurven polymorphe Sequenz-Varianten. Keine der gefundenen Sequenzveränderungen stellte eine krankheitsauslösende Mutation für HNPCC dar. Die in dieser Arbeit erreichte Sensitivität des DHPLC-Verfahrens liegt damit bei 85,4 %. Das DHPLC-Verfahren konnte als zuverlässige und vergleichsweise kostengünstige Voruntersuchung etabliert werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 8 1.1 Das hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (hereditary non-polyposis colorectal Cancer; HNPCC) 8 1.1.1 Definition, Epidemiologie und Krankheitsbild 8 1.1.2 Klinische Diagnostik 9 1.1.3 Genetische Diagnostik 11 1.1.4 Bedeutung der Diagnosestellung bei HNPCC-Patienten für die Behandlung 11 1.1.5 Molekulargenetische Grundlagen des HNPCC 13 1.2 Die hMLH1- und hMSH2-Gene 15 1.2.1 Lokalisation, Struktur und Funktion der hMHL-Gene 16 1.3 Detektion von Struktur- und Sequenzveränderungen bei HNPCC 17 1.3.1 Die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP) 18 1.3.2 Die denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 18 1.3.3 Die denaturierende Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) 19 2 Ziele dieser Arbeit 23 3 Patienten, Material und Methoden 24 3.1 Patienten 24 3.2 Materialien und Geräte 27 3.2.1 Materialien 27 3.2.2 Technische Geräte 28 3.2.3 Reagenzien 29 3.2.4 Lösungen und Puffer 30 3.2.5 Standards und Farbstoffe 31 3.2.6 Molekulardiagnostische Kits 31 3.2.7 Enzyme 32 3.3 Primer 32 3.4 Softwareprogramme, Datenbanken und Sequenzquellen 34 3.4.1 Software zur Schmelzpunktbestimmung 34 3.4.2 ABI PRISMTM Software zur Sequenzanalyse 34 3.4.3 Mutationsdatenbanken (Online) 34 3.4.4 DNA-Sequenzen 34 3.5 Methoden 35 3.5.1 DNA-Isolierung aus Vollblut 35 3.5.2 DNA-Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 36 3.5.3 Denaturierende Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) 38 3.5.4 DNA-Sequenzierung 41 4 Ergebnisse 46 4.1 Quantität und Qualität der isolierten DNA 46 4.1.1 DNA-Schmelzpunkt- und Fließgradienten-Bestimmung mittels WAVE®Maker-Software 47 4.1.2 Fragmentanalyse mittels DHPLC 49 4.2 DNA-Sequenzierung 54 4.2.1 Polymorphismen 55 5 Diskussion 61 5.1 Genotyp- und Phänotyp-Beziehung 61 5.1.1 Erstmanifestationsalter und Tumorspektrum 61 5.1.2 Fehlender Mutationsnachweis 62 5.2 DHPLC-Methode als Screening-Verfahren 65 5.2.1 Zeitersparnis 65 5.2.2 Kostenersparnis 67 5.2.3 Nachweisgenauigkeit 67 5.2.4 Nachweis von Sequenzvarianten 68 5.2.5 Chromatogramm-Interpretation 70 5.2.6 Anfälligkeiten für Störfaktoren 71 6 Zusammenfassung der Arbeit 73 7 Literaturverzeichnis 75 7.1 Web-Adressen 86 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 89 9 Lebenslauf 90 10 Danksagung 9