Morphologisch-funktionelle Charakterisierung equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen in Monokultur unter Einbeziehung immunzytologischer und transmissionselektronenmikroskopischer Methoden

Ziel der vorliegenden Arbeit war die morphologische und funktionelle Charakterisierung endometrialer Epithel- (EEZ) und Stromazellen (ESZ) des Pferdes bei separater Primärkultur auf permeablen Kunststoffoberflächen mit Hilfe (immun-)zytologischer, zytochemischer und transmissionselektronenmikroskopischer Untersuchungen, ein-schließlich einer vergleichenden Betrachtung der immunhistologischen und histochemischen Eigenschaften der Epithel- und Stromazellen in situ. Mögliche Zusammenhänge zwischen der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung und den Zelleigenschaften in vitro sollten überprüft werden. Zur Zellgewinnung dienten transzervikal entnommene Endometriumbioptate (n = 14) sowie vollständige Uteri euthanasierter Stuten (n = 6). Parallel entnommene Gewebeproben wurden fixiert und als In-situ-Vergleichsmaterial verwendet. Nach einer mechanischen und enzymatischen Gewebedissoziation erfolgte die Trennung von Epithel- und Stromazellen mittels Filtration, Dichtegradientenzentrifugation sowie Differenzialadhärenz. Ein Teil der aufgereinigten Zellen wurde Formalin-fixiert und für (immun-)zytologische und zytochemische Untersuchungen, insbesondere hinsichtlich des Separationserfolges, aufbereitet. Die Kultivierung der übrigen Zellen beider Zellarten fand separat voneinander auf unbeschichteten Membraneinsätzen (Millicell® PET) in einem Gemisch aus DMEM und Ham’s F-12 unter Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (ESZ bis ca. 60 % Konfluenz) bzw. unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserum sowie verschiedener Additive (ESZ ab ca. 60 % Konfluenz sowie EEZ) bei 37 °C in wasserdampfgesättigter, mit 5 % CO2 angereicherter Raumluft statt. Konfluente Kulturen wurden in Formalin bzw. Glutaraldehyd fixiert und für die Lichtmikroskopie respektive Transmissionselektronenmikroskopie aufgearbeitet. Zum Zeitpunkt der Zellisolierung befanden sich die Endometrien überwiegend in der Phase der physiologischen Inaktivität (n = 5) oder der regulären zyklischen sekretorischen (n = 8) bzw. proliferativen (n = 3) Aktivität. In jeweils einer der Gewebeproben war eine irreguläre sekretorische, eine irreguläre proliferative bzw. eine im Übergang zwischen Sekretion und Proliferation anzusiedelnde Funktionsmorphologie festzustellen. In einem weiteren Fall wurden die Zellen aus einem graviden Uterus isoliert. Die Separation von ESZ während des Winteranöstrus verlief mit unzureichendem Erfolg, die Kulturen zeigten eine starke Kontamination mit epithelialen Zellen. Die morphologischen, immunzytologischen und zytochemischen Eigenschaften der beiden separierten Zellpopulationen unmittelbar vor Beginn der Kultivierung ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung zwischen Epithel- und Stromazellen. Bei den aus sekretorisch differenzierten Endometrien isolierten ESZ war die Zeitdauer bis zum Erreichen der Konfluenz tendenziell länger als bei Verwendung proliferativ differenzierter Endometrien, während bei den EEZ diesbezüglich keine deutlichen Unterschiede erkennbar waren. Zum Zeitpunkt der Konfluenz konnten anhand der lichtmikroskopischen Morphologie 4 verschiedene EEZ- und 3 verschiedene ESZ-Typen nachgewiesen werden. Ultrastrukturell war eine Unterscheidung der EEZ von den ESZ möglich, innerhalb dieser beiden Zellpopulationen besaßen die lichtmikroskopisch verschiedenen Zelltypen jedoch jeweils vergleichbare Eigenschaften. Ein Zusammenhang zwischen der In-vitro-Morphologie und dem Zyklusstand zum Zeitpunkt der Zellisolierung war nicht zu erkennen. Unabhängig von der lichtmikroskopischen Morphologie wiesen die EEZ in der Regel laterale Zellverbindungen in Form von tight junctions auf, was auf einen polarisierten Phänotyp schließen lässt. Der Nachweis von Proteoglykanen mittels Alzianblau-Färbung verlief in allen kultivierten Zellen mit negativem Ergebnis. Mit Hilfe der PAS-Reaktion waren in der Mehrzahl der EEZ sowie in zahlreichen ESZ in vitro Polysaccharide/Glykoproteine nachweisbar. Die kultivierten EEZ exprimierten stets Zytokeratin 19 und in keinem Falle Desmin; in einem Teil der Zellen konnten die Zytokeratine 8 und 18, Vimentin sowie α-Glattmuskel-Aktin nachgewiesen werden. Demgegenüber enthielten die ESZ keines der untersuchten Zytokeratine, zum Teil trat in diesen Zellen jedoch eine Expression von Vimentin, Desmin und α-Glattmuskel-Aktin auf. Insgesamt war ein eindeutiger Nachweis des zellulären Ursprungs equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen in vitro ausschließlich anhand der Zytokeratin-19-Expression möglich. Die Eigenschaften der kultivierten EEZ wichen bei der Zellisolierung aus physiologisch inaktiven Endometrien hinsichtlich der PAS-Reaktion sowie des Nachweises von Zytokeratin 8 und Vimentin von denen der aus den aktiven Endometrien gewonnenen Zellen ab. Darüber hinaus wurden keine deutlichen Einflüsse der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung auf die zytochemischen und immunzytologischen Charakteristika der kultivierten Zellen offensichtlich. Auf der Grundlage dieser Arbeit können weiterführende Untersuchungen im Zellkulturmodell des equinen Endometriums erfolgen, insbesondere hinsichtlich von Veränderungen der Zelleigenschaften bei Einwirken definierter Milieufaktoren