Investigation of the effects of IGF1R-IRS1/2 pharmacological inhibition on the phenotype of BCR-ABL1+ leukemic cells

Leucemia mieloide crônica (LMC) é uma neoplasia hematológica maligna associada à atividade tirosinoquinase da oncoproteína BCR-ABL1. A maioria dos casos de LMC é tratada com sucesso com inibidores tirosinoquinase de BCR-ABL1, mas uma porcentagem significativa de pacientes desenvolve resistência ao fármaco. Estudos recentes indicam que a célula-tronco leucêmica é resistente ao tratamento com imatinibe. A identificação de outras proteínas que cooperam com as vias de sinalização BCR-ABL1 podem indicar novos alvos terapêuticos. Os substratos do receptor de insulina (IRS) têm emergido como proteínas importantes na fisiopatologia de neoplasias sólidas e hematológicas. Um inibidor farmacológico de IGF1R-IRS1/2, NT157, foi desenvolvido e mostrou resultados promissores em estudos pré-clínicos com tumores sólidos. A associação constitutiva de IRS1 com BCRABL1 e o efeito antineoplásico resultante do silenciamento espefício de IRS1 em células K562 BCR-ABL1+ suportam a hipótese deste trabalho. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da inibição farmacológica de IGF1R-IRS1/2 no fenótipo de células hematopoéticas leucêmicas BCR-ABL1+ utilizando células primárias, células K562 e modelos murinos. IRS1, mas não IRS2, apresentou-se menos expresso em amostras de medula óssea de pacientes com diagnóstico de LMC quando comparadas às amostras de células hematopoéticas normais (p<0,0001). NT157 reduziu a formação de colônias de células primárias de pacientes com LMC, mas não de células hematopoéticas de indivíduos saudáveis. Em células K562, o tratamento com o inibidor farmacológico de IGF1R-IRS1/2, NT157, reduziu a viabilidade e proliferação celular e induziu apoptose (p<0,05), inibiu a fosforilação de IGF1R, STAT3, STAT5, 4EBP1, P70S6K e ERK1/2, aumentou a expressão dos genes supressores de tumor CDKN1A, FOS e JUN e reduziu a expressão dos oncogenes MYC e BCL2 (p<0,05); a inibição específica de IRS1 através de lentivírus, mas não de IRS2, reduziu a viabilidade celular (p<0,05). Em células murinas Ba/F3 BCR-ABL1 e BCRABL1T315I, o inibidor farmacológico de IGF1R-IRS1/2, NT157, induziu apoptose e reduziu ativação de ERK1/2 in vitro. Na dose de 50mg/kg/dia, NT157 intraperitoneal e/ou imatinibe por gavagem falharam em reduzir o crescimento tumoral in vivo em modelo de tumor alográfico induzido por células Ba/F3 BCR-ABL1 e BCR-ABL1T315I. Em modelo animal de leucemia induzido por transplante de células hematopoéticas transduzidas com BCR-ABL1: (i) o tratamento com NT157 100mg/kg intraperitoneal, 3 vezes por semana, combinado com imatinibe 100mg/kg/dia por gavagem, reduziu significativamente o peso do baço, e preveniu a perda de peso comparado com veículo (p<0,05); apenas a monoterapia com imatinibe prolongou a sobrevida dos animais, (ii) o tratamento com NT157 70mg/kg intraperitoneal, 3 vezes por semana, e/ou imatinibe 70mg/kg/dia por gavagem não teve impacto no peso do baço e na variação do peso corporal; o tratamento com imatinibe em monoterapia ou combinado com NT157 prolongou a sobrevida dos animais (p<0,05). Em conclusão, o inibidor farmacológico de IGF1R-IRS1/2 representa uma droga potencialmente eficaz no tratamento da LMC, especialmente em casos de resistência com mutação BCR-ABL1 T315I. A avaliação da eficácia do inibidor farmacológico NT157 em modelos animais de LMC exige ajustes nos modelos murinos utilizados no presente estudo, melhor entendimento da farmacodinâmica e farmacocinética do composto e ajustes no esquema terapêutico utilizado.Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematological malignancy associated with the tyrosine kinase activity of the BCR-ABL1 oncoprotein. Most cases of CML are successfully treated with BCR-ABL1 tyrosine kinase inhibitors, but a significant percentage of patients develop resistance. Recent studies indicate that leukemic stem cell is resistant to imatinib treatment. The identification of other proteins that cooperate with the BCR-ABL1 signaling pathway may indicate novel therapeutic targets. Insulin receptor substrates (IRS) have emerged as important proteins in the pathophysiology of solid and hematological neoplasms. A pharmacological inhibitor of IGF1R-IRS1/2, NT157, has been developed and shown promising results in preclinical studies with solid tumors. The constitutive association of IRS1 with BCR-ABL1, and the antineoplastic effects resulting from IRS1-specific silencing in K562 BCR-ABL1+ cells, support the hypothesis of this work. The aim of the present study was to investigate the effect of pharmacological inhibition of IGF1R-IRS1/2 on the phenotype of BCR-ABL1+ leukemia cells, using primary cells, K562 cell line and murine models. IRS1, but not IRS2, was downregulated in bone marrow samples from CML patients compared to bone marrow cells from healthy donors (p<0.0001). NT157 reduced colony formation of primary cells from CML patients but not from healthy donors. In K562 cells, treatment with the pharmacological inhibitor IGF1R-IRS1/2, NT157, reduced cell viability and proliferation, induced apoptosis (p<0.05), inhibited the phosphorylation of IGF1R, STAT3, STAT5, 4EBP1, P70S6K and ERK1/2, increased expression of tumor suppressor genes CDKN1A, FOS and JUN, and reduced expression of oncogenes MYC and BCL2 (p<0.05); IRS1 silencing mediated by lentivirus, but not IRS2, reduced cell viability (p<0.05). In murine Ba/F3 BCRABL1 and Ba/F3 BCR-ABL1T315I cells, the pharmacological inhibitor of IGF1R-IRS1/2, NT157, induced apoptosis and reduced ERK1/2 activation in vitro. At 50mg/kg/day, NT157 intraperitoneally and/or imatinib orally, failed to reduce tumor burden in vivo in an allographic tumor model induced by Ba/F3 BCR-ABL1 and Ba/F3 BCR-ABL1T315I cells . In an animal leukemia model induced by transplantation of BCR-ABL1-transduced hematopoietic cells : (i) treatment with NT157 100mg/kg intraperitoneally, 3 times per week, combined with imatinib 100mg/kg/day per gavage, significantly reduced spleen weight, and prevented weight loss compared to vehicle (p<0.05); only imatinib monotherapy prolonged survival (p<0.05), (ii) treatment with NT157 70 mg/kg intraperitoneally, 3 times per week, and/or imatinib 70 mg/kg/day per gavage had no impact on spleen weight and body weight; treatment with imatinib alone or combined with NT157 prolonged survival (p