Analysis of the variation on chlorogenic acids\' concentration towards different post-harvest treatments

Considerando que diversas atividades biológicas dos ácidos clorogênicos já foram descritas na literatura, uma melhor compreensão da biossíntese e do acúmulo desses polifenois nas plantas está diretamente vinculada aos parâmetros de qualidade de fitoterápicos. Este trabalho teve o objetivo de monitorar a variação na concentração de metabólitos secundários do grupo dos ácidos clorogênicos no tecido foliar de diversas espécies diante de diferentes tratamentos pós-coleta. Este monitoramento foi realizado através da quantificação das substâncias por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em sequência (CLUE-EM/EM). Na primeira fase do estudo, foram coletadas folhas de cada espécie selecionada para o estudo (Caju - Anacardium occidentale L.; Graviola - Annona muricata L.; Pata-de-Vaca - Bauhinia variegata L.; Limão - Citrus limon (L.) Burm. f.; Café - Coffea arabica L.; Pitanga - Eugenia uniflora L.; Alecrim - Rosmarinus officinalis L., e Jambolão - Syzygium cumini (L.) Skeels). As folhas foram submetidas a um processo de extração e os extratos obtidos foram analisados por CLAE-EM/EM. Foram encontradas nove substâncias monossubstituídas nas posições 3, 4 e 5 pertencentes aos subgrupos dos ácidos p-cumaroilquínicos, cafeoilquínicos e feruloilquínicos dos ácidos clorogênicos, além de ácidos dicafeoilquínicos. A identificação dos sinais cromatográficos foi realizada por meio dos padrões de fragmentação de cada composto. Na segunda fase do estudo, foram coletadas quatro folhas dos indivíduos em estudo. As folhas foram congeladas em nitrogênio líquido (para interrupção do metabolismo) em tempos diferentes: imediatamente após a coleta (T0), 30 min após a coleta (T0,5), 1 h após a coleta (T1) e 2 h após a coleta (T2). Este procedimento foi realizado uma vez por mês durante seis meses. Em outro momento foram retiradas seis folhas de três indivíduos de espécies selecionadas (Alecrim, Pitanga, Pata-de-Vaca, Limão e Café) e cada folha foi congelada nos tempos T0 (imediatamente após a coleta), T6 (6 h após a coleta), T12 (12 h após a coleta), T24 (24 h após a coleta), T48 (48 h após a coleta) e Ts (após secagem das folhas - aproximadamente 30 dias após a coleta). O material coletado foi extraído e analisado por CLUE-EM/EM, no modo MRM. O método analítico quantitativo foi validado, considerando os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão. As concentrações dos ácidos clorogênicos em estudo não apresentaram um padrão de variação que se relacione com os tempos de tratamento ou um aumento linear nas respostas dentro do intervalo de 2 h após o início do catabolismo do tecido. As amostras com tempos de tratamento mais longo, por sua vez, apresentaram aumento significativo de diversos compostos nas folhas que não tiveram seu metabolismo interrompido 30 dias após a coleta. Este acúmulo de ácidos clorogênicos corrobora a hipótese de que o aumento da concentração destes compostos pode estar relacionado ao catabolismo de polímeros fenólicos de maior massa.Considering that diverse chlorogenic acids\' biological activities have been described, a better understanding of their biosynthesis and accumulation is closely related to phytotherapics\' quality parameters. This research aimed to monitor the variation on the concentration of secondary metabolites from the chlorogenic acids\' group on the leaf\'s tissue of diverse species, towards different post-harvest treatments. The monitoring was performed through the quantification of the compounds by UPLCMS/ MS. On the first phase of the project, leaves from each selected species (Cashew - Anacardium occidentale L.; Soursop - Annona muricata L.; Pata-de-Vaca - Bauhinia variegata L.; Lemon - Citrus limon (L.) Burm. f.; Coffee - Coffea arabica L.; Cherry - Eugenia uniflora L.; Rosemary - Rosmarinus officinalis L., and Jambolan - Syzygium cumini (L.) Skeels) were harvested. This material was submitted to an extraction process, and the obtained extracts were analyzed by HPLC-MS/MS. Nine substances were found, monossubstituted on positions 3-, 4- and 5-, belonging to the subgroups of p-coummaroylquinic, caffeoylquinic and feruloylquinic acids, in addition to dicaffeoylquinic acids. The chromatographic signals\' identification was preceded observing the fragmentation pattern of each compound. On the second phase of the study, four leaves were collected from each individual. The leaves were frozen with liquid nitrogen (to interrupt the metabolism) on different moments - immediately after the collection (T0), 30 min after de collection (T0,5), 1 h after the collection (T1) and 2 h after the collection (T2). This procedure happened once a month during six months. On August, 2016, a different collection was performed for a broader observation: six leaves were harvested from three individuals from selected species (Rosemary, Cherry, Pata-de-Vaca, Limon and Coffee), and each leave was frozen on T0 (immediately after the collection), T6 (6 h after the collection), T12 (12 h after the collection), T24 (24 h after the collection), T48 (48 h after the collection) and Ts (after leaf\'s drying - approximately 30 days after collection). The harvested material was extracted and analyzed by UPLC-MS/MS, on MRM mode. The analytical method was validated for linearity, accuracy and precision. Chlorogenic acids\' concentrations did not show a pattern of variation that related to the different treatments or a linear increase on response until 2 hours after the beginning of the tissue catabolism. The samples submitted to a broader treatment interval, however, showed a significant rise on the concentration of different compounds, on leaves that did not have their metabolism interrupted until 30 days after the collection. This accumulation of chlorogenic acids agrees with the hypothesis that the raise on the concentration of these substances can be related to the catabolism of polymeric phenols of higher mass