Cytotoxic and cytostatic effects of new mTOR inhibitors in bi and tridimensional cultures of prostate cancer (DU145) and hepatocarcinoma (HepG2)

O desenvolvimento de novas terapias para o câncer envolve um processo longo e custoso no qual apenas 5% dos candidatos a fármacos em ensaios clínicos são aprovados. Os ensaios celulares são um importante pilar neste processo, no entanto, eles são geralmente feitos em células cultivadas em monocamada, o que apresenta algumas limitações. Assim, o desenvolvimento e aplicação de modelos tridimensionais (3D) para ensaios pré-clínicos tem sido cada vez mais investigado, devido a suas maiores similaridades com tumores in vivo em relação a características físicas, espaciais e bioquímicas. A via PI3K-AKT-mTOR, que está frequentemente desregulada em diversos cânceres, é uma rota metabólica essencial por integrar fatores de crescimento e sinais internos com a expressão de proteínas relacionadas ao crescimento celular. Sendo assim, novos compostos inibitórios dessa via têm sido estudados pelo grupo NEQUIMED como alternativa terapêutica para essas doenças. Dessa forma, este trabalho teve o objetivo de avaliar o potencial citostático e citotóxico de novos inibidores da via da mTOR em culturas celulares bi e tridimensionais de câncer de próstata e hepatocarcinoma. Para isso, o modelo de cultura 3D foi padronizado para ambas linhagens usando duas técnicas diferentes, além da padronização da técnica de redução da resazurina para a determinação da viabilidade celular em 2D e 3D. No ensaio citotóxico, células em monocamada e esferoides foram tratadas com diferentes concentrações dos fármacos de referência e dos novos inibidores e tiveram sua viabilidade determinada pelo ensaio de redução da resazurina. Já para o ensaio citostático, baixas concentrações de células foram plaqueadas em monocamada e tratadas por até 6 dias, tendo sua viabilidade medida a cada 48 h pelo ensaio de MTT. Os esferoides foram tratados por 9 dias com as mesmas substâncias, tendo seu volume medido a cada 3 dias. No geral, os novos compostos não apresentaram efeitos citotóxicos relevantes, contudo, os compostos Neq0438 e seu análogo, Neq0679, tiveram maior efeito citostático que a Rapamicina em culturas 2D e 3D de HepG2. Além disso, os compostos tiveram maior efeito citostático em esferoides do que em células cultivadas em monocamada para as duas linhagens. Isso pode ser justificado pela alteração na expressão de proteínas da via da mTOR em relação ao modelo de cultura, já que foi demonstrado sua maior ativação nos modelos tridimensionais. Futuramente esses compostos poderão ser testados sozinhos, ou em terapia combinada em modelos animais para melhor avaliação de sua segurança e sua evolução no estudo pré-clínico.The development of new cancer therapies involves a long and expensive process in which only 5% of the clinical trial candidates for new drugs get approval. Cell assays are an essential pillar in this process; however, they are usually carried out in cells grown as a monolayer, which have some limitations. Thus, the development and application of new tridimensional (3D) models for preclinical trials has been deeply investigated, due to their higher similarities with in vivo tumors, regarding physical, spatial and biochemical features. The PI3K-AKT-mTOR pathway, which integrates growth factors and the expressions of proteins for the cellular growth, is often upregulated in several types of cancer. Hence, the NEQUIMED group is studying new pathway inhibitors as a therapeutic alternative for cancer. Here, the cytotoxic and cytostatic effects of the new PI3K-AKT-mTOR inhibitors were assessed in two and three-dimensional cells models of prostate cancer and hepatocarcinoma. To that end, the 3D culture model was standardized for both cell lines using two different techniques. The resazurin reduction assay was also standardized to determine cell viability in 2D and 3D models. For the cytotoxic assay, cells grown in a monolayer and 3D spheroids were treated with a range of concentrations of the reference drugs and new mTOR inhibitors and had their viability assessed by the resazurin assay. For the cytostatic assay, low cell density was plated on 2D and treated for 6 days, having their viability determined every 48 h using the MTT assay. Spheroids were treated for 9 days with the same substances and had their volume measured every 3 days. Overall, the new mTOR inhibitors did not show relevant cytotoxic effects, however, Neq0438 and its analog Neq0679, had a higher cytostatic effect than Rapamycin for both 2D and 3D cultures of HepG2. Besides, all mTOR inhibitors had a higher cytostatic effect on 3D cultures when compared to monolayers, which can be related to the overexpression of the mTOR pathway in this culture system, already reported on the literature. Based on these results, Neq0438 and Neq0679 should now be used alone or in combination using in vivo models to investigate their antitumoral effects