New response regulators involved in Pseudomonas aeruginosa virulence

Os sistemas de sinalização de dois componentes são sistemas prevalentes em bactérias, permitindo a adaptação a diferentes condições ambientais. O sistema de dois componentes classicamente possui uma proteína histidina quinase, o primeiro componente, capaz de reconhecer o estímulo ambiental e fosforilar o regulador de resposta, o segundo componente. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria ubíqua, capaz de infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Esse patógeno oportunista apresenta um dos maiores conjuntos de sistemas de dois componentes em bactérias, que permite que ela sobreviva numa grande gama de ambientes, incluindo humanos. P. aeruginosa UCBPP-PA14 apresenta pelo menos 64 histidina quinases e 76 reguladores de resposta codificados em seu genoma. Diversos sistemas de dois componentes já foram correlacionados com a virulência, sendo o sistema GacSA o exemplo melhor caracterizado. Há poucos estudos sistemáticos sobre o envolvimendo dos reguladores de resposta na virulência de P. aeruginosa e os sinais que induzem a ativação dos reguladores de resposta precisam ser encontrados. Para identificar novos reguladores de resposta envolvidos na patogenicidade, infecções in vitro em macrófagos e in vivo em Drosophila melanogaster foram realizadas neste trabalho. Os macrófagos foram infectados com cada mutante dos reguladores de resposta ou com a linhagem selvagem, e a produção da citocina pró-inflamatória TNF-α e o clearance bacteriano foram determinados. Alternativamente, as moscas foram infectadas utilizando-se a estratégia de feeding e a sobrevivência foi verificada. Utilizando-se essas abordagens, a identificação de diversos reguladores de resposta com papel na virulência foi alcançada, além de se corfirmar o papel de reguladores de resposta já estudados. Um dos novos genes envolvidos em virulência, PA14_26570 (nomeado neste trabalho de atvR), codifica um regulador de resposta atípico com substituição no aspartato fosforilável para glutamato, o que usualmente induz um estado sempre ativo. Um mutante não polar em atvR foi construído e macrófagos infectados com a linhagem ΔatvR confirmaram um maior clearance bacteriano e maior produção de TNF-α em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Para comprovar a participação de AtvR durante a patogênese, um modelo de pneumonia aguda em camundongos foi utilizado. Camundongos infectados com a linhagem ΔatvR apresentaram uma maior sobrevivência em comparação aos camundongos infectados com a linhagem selvagem. Além disso, os camundongos infectados com ΔatvR apresentaram menor carga bacteriana, aumento no recrutamento de neutrófilos ativados e aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ). Utilizando-se uma abordagem transcritômica (RNA-Seq), foi determindo diversos genes são regulados positivamente na linhagem superexpressando AtvR em relação à linhagem controle. Dentre esses, os clusters de respiração anaeróbia nar, nir, nor e nos estão incluídos. Esse resultado foi confirmado por qRT-PCR e análises fenotípicas, em que a linhagem ΔatvR apresentou menor crescimento e expressão da nitrato redutase durante condições de hipóxia em comparação à linhagem selvagem. Em suma, neste trabalho foi demonstrado que diversos reguladores de resposta são importantes para a virulência de P. aeruginosa em macrófagos in vitro e in vivo em Drosophila, além de caracterizar o regulador de resposta atípico AtvR, que regula a respiração anaeróbica por desnitrificação, permitindo que P. aeruginosa possa infectar e colonizar o hospedeiro com maior eficiência.Two-component systems are widespread in bacteria, allowing the adaptation to environmental changes. A two-component system is classically composed by a sensor kinase that phosphorylates a cognate response regulator. Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous proteobacterium able to cause disease in several hosts. This opportunistic pathogen presents one of the largest sets of two-component systems known in bacteria, which certainly contributes to its ability to thrive in a wide range of environmental settings, including humans. P. aeruginosa UCBPP-PA14 genome codes for at least 64 sensor kinases and 76 response regulators. Some response regulators are already known to be related to virulence, with the GacSA system as the best characterized. There are no systematic studies about the involvement of P. aeruginosa response regulators in virulence. Moreover, the input signal that triggers the response regulator activation is yet to be uncovered for most systems. To find new response regulators involved in virulence, in vitro infections werecarried out using macrophages. Briefly, the macrophages were infected with each response regulator mutant or the wild-type strain, the pro-inflammatory cytokine production (TNF-α) and the bacterial clearance were evaluated. Using this approach, we identified several response regulators involved in virulence, and we also confirmed the involvement of known response regulators in this process. One of the novel virulence-related response regulators, PA14_26570 (named here as AtvR), is an atypical response regulator with a substitution in the phosphorylable aspartate to glutamate, that usually leads to an always-on state. A non-polar mutant was constructed, and macrophage infection with ΔatvR confirmed an increased bacterial clearance as well as a higher TNF-α production as compared to the wild-type strain. To ascertain the role of AtvR during the pathogenic process, an acute pneumonia model was used. Mice infected with ΔatvR showed an increased survival as compared to mice infected with the wildtype strain. In addition, ΔatvR infected mice showed reduced bacterial burden, increased neutrophil recruitment and activation, as well as increased pro-inflammatory cytokine production (TNF-α and IFN-γ). Also, using a transcriptomic approach (RNASeq), we showed that several genes were upregulated in the strain overexpressing AtvR. These genes include the anaerobic respiration clusters nar, nir, nor and nos. This result was confirmed by qRT-PCR and phenotypic analysis, in which ΔatvR showed reduced growth and nitrate reductase expression during hypoxic conditions as compared to the wild-type strain. In conclusion, we have demonstrated that several response regulators are important for P. aeruginosa virulence in vitro. In addition, we further characterized the atypical response regulator AtvR, which regulates anaerobic respiration via denitrification, allowing this bacterium to infect and colonize the host more efficiently