Efecto del estrés agudo por restricción de movimiento sobre el estado de fosforilación procesamiento y localización de CRMP2 en hipocampo de rata adulta

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al Título de BioquímicoEl estrés corresponde a una respuesta del organismo que se desencadena frente a una situación donde el individuo se siente amenazado, que promueve la adaptación y sobrevida del mismo. Esta respuesta es específica, pues involucra la activación de distintos circuitos neuronales y la liberación de mediadores humorales dependiendo del tipo de agente “estresante”. En el caso del estrés psicosocial se liberan principalmente glucocorticoides (hormonas esteroidales) y catecolaminas, provocando cambios en la expresión génica y en la transducción de señales tanto a nivel central como periférico. Las áreas que son blanco de las hormonas del estrés y en especial de los glucocorticoides incluye la formación hipocampal (Cuerno de Ammón, CA y giro dentado) que participa en la memoria declarativa, la amígdala que participa en la respuesta al miedo y la corteza frontal asociada a la memoria de trabajo. Estudios morfológicos y bioquímicos han demostrado que las variaciones en los niveles de glucocorticoides secretados durante el ciclo circadiano y durante el estrés promueve modificaciones neuroplásticas en estas estructuras, especialmente en el hipocampo, y que incluyen cambios morfológicos, modificación en la excitabilidad celular y en la eficacia sináptica. Se ha descrito que el alza en la secreción de glucocorticoides inducido por un estrés agudo (episodio único) puede actuar como un modulador positivo o negativo de los procesos de memoria y aprendizaje relacionados a la formación hipocampal. Sin embargo, se ha visto que una activación excesiva de la respuesta de estrés, así como la imposibilidad de apagarlo pueden ser altamente contraproducentes, al disminuir la capacidad plástica del tejido neural, afectando especialmente las estructuras del sistema límbico y en particular el hipocampo. Entre los múltiples efectos del estrés a nivel central, uno de los más importantes corresponde a los cambios neuroplásticos asociados a la morfología neuronal, atrofia neuronal, en especial de aquellas relacionadas a la neurotransmisión glutamatérgica. Es probable que los mediadores del estrés modifiquen la citoarquitectura neuronal a través de la modulación de cascadas de señalización involucradas en la dinámica de citoesqueleto. Entre éstas, destaca la CRMP2 (del inglés collapsin response mediator protein-2), proteína involucrada en la polimerización de microtúbulos, proceso que determina en etapas temprana del desarrollo la definición axonal. La regulación de esta proteína es diversa e involucra el procesamiento proteolítico dependiente de calcio mediado por calpaínas. La proteína procesada es transportada al núcleo y produce cambios en la sobrevida neuronal por mecanismos no precisados. Adicionalmente, estudios in vitro han demostrado que la CRMP2 pierde la capacidad de unirse a tubulina al ser fosforilada por la GSK3β (Thr-514) produciéndose el colapso del cono de crecimiento neuronal. Los antecedentes descritos sugieren que CRMP2 juega un rol importante en el control de la dinámica del citoesqueleto de microtúbulos, que puede contribuir a mecanismos de plasticidad, y que su acción podría verse afectada por estímulos de diversa naturaleza, como el estrés (agudo y crónico). Sin embargo no existen antecedentes que indiquen el rol ni la localización en neuronas de cerebro adulto y si se regula por fosforilación. En relación a esto último, la sobreactivación de la GSK3β (del inglés glycogen synthase kinase 3β), una serina-treonina quinasa, produce efectos deletéreos asociados a la hiperfosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos y factores transcripcionales que regulan la expresión de genes de neuroprotección. La GSK3β se encuentra constitutivamente activa y es regulada en forma negativa por una fosforilación en su extremo N-terminal (Ser-9). Debido a los efectos que se le atribuyen a esta enzima, se sugiere que participaría en las alteraciones observadas en estrés crónico, sin embargo dicha relación no se ha comprobado experimentalmente. Más aún, in vivo no se ha determinado la asociación entre la actividad de la GSK3β y el estado de fosforilación de la CRMP2. En base a estos antecedentes se propuso la siguiente hipótesis: “El estrés agudo por restricción de movimiento produce cambios en el estado de fosforilación, procesamiento y localización de CRMP2 en hipocampo de rata adulta”. Se utilizaron ratas macho adultas y se sometieron a 2,5 horas de estrés de restricción de movimiento y fueron sacrificadas inmediatamente finalizado el estímulo o luego de 1,5; 24 y 48 horas post estrés. La efectividad del estrés se comprobó por el incremento en el número de heces e incremento en el nivel de corticosterona observado por la aplicación de la restricción. A su vez, mediante inmunowestern blot se determinaron en extractos hipocampales los niveles de la proteína Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein), la que se sintetiza localmente en las dendritas y cuya función es regular la densidad de receptores glutamatérgicos sinápticos. Se observó, luego de 1,5 horas de estrés, una reducción significativa la que se mantuvo luego de 24 horas post estrés; sugiriendo un aumento en la degradación de esta proteína. En contraste, en animales estresados crónicamente durante 14 días y sacrificados 24 horas post estrés, se observó que los niveles de Arc fueron similares al control, sugiriendo que esta respuesta se adapta ante el estrés crónico. Se determinó mediante inmunowestern blot que el estrés no produjo el procesamiento proteolítico de la CRMP2. Por otra parte, luego de 1,5 horas post estrés se observó una disminución significativa en los niveles de CRMP2-P (Thr-514) la cual se reestablece al valor control luego de 24 horas post estrés. Así mismo, los niveles de GSK3β–P (Ser-9) disminuyeron de manera significativa inmediatamente post estrés que se relaciona a un aumento de la actividad y posteriormente se recuperan al valor control. Estos resultados indican que no existe relación entre la actividad de la quinasa con el estado de fosforilación de la CRMP2 y probablemente los cambios promovidos por el estrés involucran otros actores no considerados en esta tesis como las fosfatasas. Por otra parte en muestras de animales crónicamente estresados y sacrificados 24 horas posterior al tratamiento no presentaron cambios respecto al control. Finalmente se evaluó la localización celular de CRMP2-P mediante inmunohistoquímica en distintas zonas y estratos hipocampales. Se determinó que la inmunoreactividad de CRMP2-P es coincidente con la de un marcador de dendritas maduras (MAP2A) y se observó que existe una acumulación nuclear de CRMP2-P a las 24 horas post estrés en el estrato piramidal CA1 y CA3. Esta tesis demuestra por primera vez que el estrés agudo de restricción de movimiento promueve cambios en el estado de fosforilación de la CRMP2 lo que no se correlaciona con la actividad de la GSK3β. Será muy informativo poder precisar cambios en el estado de fosforilación de estas proteínas durante el estrés con el fin de poder definir nuevos actores en estas respuestas. Como por ejemplo, se debe precisar la contribución de otras quinasas y de fosfatasas en asociación a estos cambios. Por otro lado, se demostró en animal adulto que esta proteína tiene una localización dendrítica lo que hace postular un rol en neuronas adultas. Queda por determinar si efectivamente la CRMP2-P se transporta al núcleo en respuesta al estrés agudo. Así mismo se demostró que el estrés crónico produce una adaptabilidad de la fosforilación de CRMP2-P y GSK3βStress is a physiological response that allows adaptation and survival and it triggered when an individual feels threatened. This response is specific and involves the activation of numerous neural circuits and the secretion of different humoral mediators depending on the stressor. In the case of psychosocial stress, glucocorticoids and catecholamines are released into the blood stream, promoting changes on gene expression and signal transduction pathways at a central and peripheral level. The brain areas that are sensitive to stress hormones, especially to glucocorticoids, are the hippocampal formation (Ammon’s Horn, CA and dentate gyrus) involved in declarative memory; the amygdala related to fear response, and the frontal cortex associated to working memory. Morphological and biochemical studies have shown that fluctuation on glucocorticoids levels, due to stress or circadian rhythm, are required to promote changes in neuroplasticity in these brain structures, especially in the hippocampus. These neuroplastic changes include variations in morphology, modification on cellular excitability and synaptic efficiency. It has been reported that an increase on glucocorticoid secretion due to an acute stress (one episode) may act as a positive or a negative modulator of memory and learning processes involving the hippocampus. Nevertheless, an excessive activation of the stress response, as to the inability to terminate it properly, may be highly detrimental due to the negative effect of stress on neuroplasticity, specially the hippocampus. One of the most important effects at a central level associated with stress is the neuroplastic changes on neural morphology, mainly neural atrophy, especially those related with glutamatergic neurotransmission. It is possible that stress mediators promote modification of neural cytoarchitecture through the modulation of signal transduction pathways involved in cytoskeleton dynamics. Among these, we highlight CRMP2 (collapsin response mediator protein 2), whose involved on microtubule polymerization, an event that determinates axon specification at early embryonic stages. This protein is regulated by differents mechanisms involving calcium dependent proteolytic cleavage by calpains. The processed protein translocates to the nucleus and promotes changes in neural survival through mechanisms not full understood. In addition, in vitro studies have demonstrated that CRMP2 loses its tubulin binding ability when phosphorylated by GSK3β (Thr-514), provoking neural growth cone collapse. These evidences suggest that CRMP2 plays a pivotal role on cytoskeleton dynamics and can contribute to plasticity mechanisms. Additionally, its function could be affected by different types of stimuli, including acute and chronic stress. However there is no evidence about its function and location in adult brain neurons and neither if CRMP2 is regulated by phosphorylation. Regarding this event, it is known that the over activation of the serin-threonin kinase GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) results in deleterious effects associated with the hyperphosphorylation of microtubule associated proteins and transcription factors involved in gene expression regulation. GSK3β is constitutively active and regulated by an inhibiting phosphorylation in its N-terminal portion (Ser-9). It has been suggested that GSK3β would participate in the alterations observed on chronic stress, based mainly on their targets: Nonetheless, this relationship has not been proved experimentally. Even more, the association between the activity of GSK3β and phosphorylation state of CRMP2 has not been proved in vivo. Based on this evidence the following hypothesis was proposed “acute restraint stress causes changes on the phosphorylation, processing and cellular localization of CRMP2 in adult rat hippocampus” Adult male rat were subjected to a single 2.5 hours restriction stress session and then euthanized immediately after the stimuli or after 1,5; 24 and 48 hours after stress. The effectiveness of the stress model was proved by the increase in the number of feces and corticosterone levels produced by the restriction protocol. Also Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) protein levels where determined on hippocampal extract by inmunowestern blot. This protein is locally synthetized on dendrites and regulates the synaptic density of glutamatergic receptors. There was a significant reduction in Arc levels 1.5 hours post stress, which remained until 24 hours post stress, suggesting an increase in its degradation. In contrast, such a decrease was not observed on chronically stressed animals euthanized 24 post stress, suggesting that this response adapts in chronic stress. In addition we determined by inmunowestern blot that acute restraint stress does not promote CRMP2 cleavage. Also we proved by inmunowestern blot that acute restraint stress decreases the levels of CRMP2-P (Thr-514) at 1.5 hours post stress and the level is reestablished at 24 hours post stress. Likewise GSK3β–P (Ser-9) levels decreased immediately after stress which relates with an increase in its activity, and then return to control levels. These results indicate that there is no relation between the kinase activity and CRMP2 phosphorylation status. These results raise the possibility that changes induced by stress can involve other proteins that were not considered in this Thesis, like phosphatases. We also determined GSK3β–P levels on chronic stressed animals euthanized 24 hours after the last stress session and found no significant changes in comparison to control animals. Finally we determined by immunohistochemistry the location CRMP2-P in different hippocampal zones and stratum from animals euthanized at 0, 1.5; and 24 hours post stress. We determined that CRMP2-P immunoreactivity co-localized with a mature dendrite marker (MAP2A). We also observed that there is a nuclear accumulation of CRMP2-P on stratum pyramidale of CA1 and CA3 24 hours after stress. This thesis shows by the first time that acute restriction stress promote changes in the phosphorylation state of CRMP2 that does not correlates with GSK3β activity. It would be very informative to determine the changes in the phosphorylation state of these proteins during stress to elucidate the role of new actors on this response. For example, the contribution of other kinases and phosphatases to these changes must be elucidated. On other aspect, we show that CRMP2 has a dendritic localization in the adult brain, which denotes a function in adult neurons. It remains to be determined if acute stress effectively promotes CRMP2-P nuclear translocation. Also we demonstrated that chronic stress induces adaptability in the phosphorylation of CRMP2 and GSK3β